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ヒトDNA複製開始反応関連蛋白質が結合しているゲノムDNA領域の同定

人类 DNA 复制起始反应相关蛋白结合的基因组 DNA 区域的鉴定

基本信息

批准号：
11143215
负责人：
藤田雅俊
金额：
$ 1.22万
依托单位：
Aichi Cancer Center Research Institute
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (A)
财政年份：
1999
资助国家：
日本
起止时间：
1999 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

本研究の目的はORC、CDC6、MCM等の複製開始蛋白がin vivoで結合しているゲノムDNA領域を同定することである。まず、従来より行ってきたMCMとクロマチンの結合をATPで安定化し、制限酵素で可溶化し免疫沈降でMCM-クロマチン複合体を単離するという方法を用い、そのクロマチンDNAを幾つかクローニングした。しかし当初期待していた配列上の類似性は認められず、また平行して行っていた生化学的検討から、MCMの結合部位が、ORCやCDC6の結合部位とまったく同じではないことが分かってきたので、これらが複製開始点とどのような関係になっているかを各々の部位について検討するのは困難が予想されたので行わなかった。そこで、すでに複製開始点であることが示されており、生物学的にも興味深いグロビン領域を標的に、ホルマリンクロスリンクを用いたクロマチン免疫沈降法を行うべく検討を始めた。ホルマリンクロスリンク法については、酵母では成功例の報告が多いが、ヒト等の高等真核生物においてはその核構造の複雑性ゆえか、成功例は少なく、至適条件も確立されていない。申請者らは最近ようやく至適と考えられる条件を確立した。この条件設定は、申請者らが従来行ってきた研究において明らかにしてきたヒト複製制御蛋白の核内制御をもとに、それがクロスリンクによってどれだけ保持できるかと言うことを指標に行った。すなわち、可溶型は架橋後も界面活性剤で可溶化されるが、結合型はクロマチンやマトリックスに架橋され、本来は可溶化される高塩処理によっても可溶化されないという条件をさがした。本法を用いることによって、グロビン領域における複製開始蛋白の結合の同定が可能となってきており、現在検討を精力的に進めつつある。

The purpose of this study is to copy ORC, CDC6, MCM, and so on, to start the protein in vivo assay combined with the DNA field to identify the same target protein. In this study, we used the combination of MCM and DNA to stabilize the enzyme, to make the enzyme soluble, to immunize the MCM-, to isolate the complex, to use the method to isolate the enzyme, and to use the enzyme to stabilize the enzyme. At first, we expected that we would like to have the same number of similarities, parallel lines, biochemical markers, MCM binding sites, ORC CDC6 bonding sites, and so on. At the starting point of the copy, do you want to start the copy? do you want to start the copy? if you want to start the copy, you may want to do so. The starting point of replication is to show that there is a deep taste in biology, that in the field of medicine, in the field of biology, in the field of medicine, in the field of biology, in the field of biology, in the field of medicine, in the field of medicine, the immune sedimentation method is used to detect the beginning of the disease. There are many successful reports on eukaryotes, such as high-level eukaryotes, high-level eukaryotes, small numbers of successful cases, and so on. Applicants are required to make sure that the conditions are confirmed. The conditions are set and the requestor is required to do the research. It is necessary to make a copy of the control protein in the nucleus. it is necessary to make a copy of the protein in the nucleus. The results show that the interfacial activity of the soluble frame is different from that of the soluble frame, the interfacial activity of the soluble frame is different from that of the soluble frame, the interfacial activity of the soluble frame, the soluble frame, the This method is based on the information system and the field information system. The starting protein of the copy protein is combined with the same result that it is possible to improve the performance of the system.