Oct-3/4による初期分化決定機構の解析

Oct-3/4分析早期分化决定机制

• 批准号: 11154214
• 负责人: 丹羽 仁史
• 金额: $ 1.15万
• 依托单位: Osaka University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (A)
• 财政年份: 1999
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1999 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-11154214/
• 关键词: ES細胞; 転写因子; Oct-3; 4

1.研究目的未分化細胞特異的に発現する転写因子Oct-3/4は、我々のES細胞を用いた解析から、ES細胞の未分化状態を維持するためにはその一定量の発現が維持されることが必要であり、発現量の減少は栄養外胚葉への、増加は原始内胚葉への分化を誘導することが明らかになった(Niwa H.et al,Nat.Genet.,in press)。そこで、本研究では、このOct-3/4による遺伝子発現調節機構およびそれによる未分化状態維持/分化運命決定機構の解明を目的とし、次の3点の解析を行った。(1)Oct-3/4による転写活性化機構の解析(2)Oct-3/4の発現量増加による原始内胚葉分化誘導機構の解析(3)Oct-3/4の発現量減少による栄養外胚葉分化誘導機構の解析2.研究成果(1)転写因子Oct-3/4と結合する因子を単離するために、EGFP-Oct-3/4融合蛋白の発現によって未分化状態を維持されたES細胞GOWT1を樹立した。(2)(1)で得られた細胞の可溶化物を坑GFP坑体を用いて免疫沈降し、沈降物をSDS-PAGE法で解析し、未分化状態特異的に共沈してくる3つのバンド(CO1-3)を同定した。(3)(2)で同定されたバンドを単離してN端部分アミノ酸配列解析法および質量分析法で解析したところ、CO-1,3は細胞骨格成分の蛋白で、アーチファクトと考えられたが、CO-2は未知の蛋白と考えられた。(4)染色体外発現ベクターを用いた強制発現と、テトラサイクリンによる発現調節系を用いて、転写因子Cdx-2の発現がES細胞の栄養外胚葉への分化を誘導することを見い出した。(5)ゲノム遺伝子の解析から、Cdx-2の発現がES細胞においてはOct-3/4によって抑制されていること、およびCdx-2が自己のプロモーターを活性化しうることをルシフェラーゼアッセイ法により明らかにした。

1. The research purpose of undifferentiated cells specific に 発 now す る planning write factor Oct - 3/4 は, I 々 の を ES cells with い た parsing か ら を の undifferentiated state, ES cells す る た め に は そ の amount の 発 が now maintain さ れ る こ と が necessary で あ り, 発 is の reduce は tech students.their ownship keep outside germ layer へ の, rights and は primitive germ layer in へ の を induction differentiation Youdaoplaceholder0 になった とが Ming ら になった になった(Niwa h. et al,Nat.Genet.,in press). そ こ で, this study で は, こ の Oct - 3/4 に よ る posthumous son 伝 発 now adjusting mechanism お よ び そ れ に よ る undifferentiated state maintenance/differentiation destiny decided to institutions の interpret を purpose と し, の 3 point line analytical を の っ た. (1)Oct-3/4による転 writing the activation mechanism <s:1> analysis (2) Increased occurrence of Oct-3/4 <s:1> analysis of the primitive endoderm differentiation-inducing mechanism <e:1> (3) decreased occurrence of Oct-3/4による 栄 analysis of the ectoderm differentiation-inducing mechanism <e:1> 2. Results (1) planning write factor Oct - 3/4 と combining す る factor を 単 from す る た め に, EGFP - Oct - 3/4 fusion protein の 発 now に よ っ て undifferentiated state を maintain さ れ た ES cells GOWT1 を set し た. (2) (1) で ら れ た cells の solubilization GFP を pit pit body を content with い て immune sink し, sink を sds-page method で し, undifferentiated state specific に shen し て く る 3 つ の バ ン ド (CO1-3) を with fixed し た. (3) and (2) with fixed さ で れ た バ ン ド を 単 from し て n-terminal part ア ミ ノ acid arrangement analytical method お よ び quality analysis で parsing し た と こ ろ, CO - 1, 3 は cells bone composition の protein で, ア ー チ フ ァ ク ト と exam え ら れ た が, CO - 2 は の unknown protein と exam え ら れ た. (4) extrachromosomal 発 now ベ ク タ ー を with い た forced 発 と now, テ ト ラ サ イ ク リ ン に よ る 発 practice while regulating department を い て, planning to write factor Cdx - 2 の 発 now が ES cells の tech students.their ownship keep outside germ layer へ を の differentiation inducing す る こ と を see い out し た. (5) ゲ ノ ム posthumous son 伝 の parsing か ら, Cdx - 2 の 発 now が ES cells に お い て は Oct - 3/4 に よ っ て inhibit さ れ て い る こ と, お よ び Cdx - 2 が himself の プ ロ モ ー タ ー を activeness し う る こ と を ル シ フ ェ ラ ー ゼ ア ッ セ イ method に よ り Ming ら か に し た.

项目成果

Burdon, T. et al: "Signaling mechanisms regulating self-renewal and differentiation of pluripotent embryonic stem cells"Cells Tissues Organs. 165. 131-143 (1999)

Burdon, T. 等人：“调节多能胚胎干细胞自我更新和分化的信号机制”细胞组织器官。

Hotz V. Taterna, M. et al: "Different regulation of mammalian Period genes and circadian rhythmicity by cryptochremes 1 and 2"Proc. Natl Acad Sci USA. 96. 12114-12119 (1999)

Hotz V. Taterna, M. 等人：“Cryptochremes 1 和 2 对哺乳动物周期基因和昼夜节律的不同调节”Proc。

Niwa, H. et al: "Quantitative expression of Oct-314 defines differentiation, dedifferentiation or self-renewal of ES cells"Nat. Genet. (in press). (2000)

Niwa, H. 等人：“Oct-314 的定量表达定义了 ES 细胞的分化、去分化或自我更新”Nat.

丹羽仁史: "ES細胞の未分化状態を維持する機構"細胞工学. 19. 384-391 (2000)

Hitoshi Niwa：“维持 ES 细胞未分化状态的机制”Cell Engineering 19. 384-391 (2000)。

Miyawaki, K. et al.: "Glucose intolerance caused by a defect in the entero-insular axis: a study in gastric inhibitory polypeptide receptor knockout mice"Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 96. 14843-14847 (1999)

Miyawaki, K. 等人：“肠岛轴缺陷引起的葡萄糖不耐受：胃抑制性多肽受体敲除小鼠的研究”Proc。