卵母細胞の核内クロマチン再構成系を用いたクロマチンを介した転写調節機構の解析

DNAmethyltransferase 3b(Dnmt3b)遺伝子はde novoのメチル化酵素の一つで、発生初期のDNAメチル化の確立に重要なことが知られている。我々は、この遺伝子の分化に伴う発現調節機構を、特に遺伝子のクロマチン構造に着目して、ES細胞分化系およびin vitroクロマチン再構成系を用いて解明することを研究目的とする。これまでに未分化なES細胞においてはDnmt3遺伝子の発現はある程度見られるが、胚葉体を形成させて分化させると直ちにEpiblastの段階でさらに発現が誘導され、分化誘導後3日でmRNA量はピークに達してから徐々に減少し、始原外胚葉に分化するとほとんど発現は見られなることがNorthern blotの結果から明らかになった。ES細胞の分化にともなう遺伝子の発現誘導と抑制の時期が明らかになったので、分化に伴うクロマチン構造の変化を、この遺伝子を含む広範囲の領域で解析するために、遺伝子を含むBACクローンを同定し現在解析を進めている。またOct3/4の発現をテトラサイクリン添加により止めるように改変されたES細胞を用いた解析から、最初の発現誘導にOct3/4が関与している結果を得た。一方、ヌクレオソームーポジショニング配列を含む独自の5S dinucleosomeを原子間力顕微鏡で観察し、これまでの生化学的解析により得られた結果と比較することにより、原子間力顕微鏡を用いたヌクレオソームの位置解析法を確立するに至った。さらに精製ヒストンを用いてポジショニングした均一な高次のoligonucleosomeの構造変化を直視的に解析するために、従来の5Sをもとに200bpからおよそ2kbpのoligonucleosomeを再構成することが可能になった。

DNAmethyltransferase 3b(Dnmt3b)遺伝子はde novoのメチル化酵素の一つで、発生初期のDNAメチル化の確立に重要なことが知られている。我々は、この遺伝子の分化に伴う発現調節機構を、特に遺伝子のクロマチン構造に着目して、ES細胞分化系およびin vitroクロマチン再構成系を用いて解明することを研究目的とする。これまでに未分化なES細胞においてはDnmt3遺伝子の発現はある程度見られるが、胚葉体を形成させて分化させると直ちにEpiblastの段階でさらに発現が誘導され、分化誘導後3日でmRNA量はピークに達してから徐々に減少し、始原外胚葉に分化するとほとんど発現は見られなることがNorthern blotの結果から明らかになった。ES細胞の分化にともなう遺伝子の発現誘導と抑制の時期が明らかになったので、分化に伴うクロマチン構造の変化を、この遺伝子を含む広範囲の領域で解析するために、遺伝子を含むBACクローンを同定し現在解析を進めている。またOct3/4の発現をテトラサイクリン添加により止めるように改変されたES細胞を用いた解析から、最初の発現誘導にOct3/4が関与している結果を得た。一方、ヌクレオソームーポジショニング配列を含む独自の5S dinucleosomeを原子間力顕微鏡で観察し、これまでの生化学的解析により得られた結果と比較することにより、原子間力顕微鏡を用いたヌクレオソームの位置解析法を確立するに至った。さらに精製ヒストンを用いてポジショニングした均一な高次のoligonucleosomeの構造変化を直視的に解析するために、従来の5Sをもとに200bpからおよそ2kbpのoligonucleosomeを再構成することが可能になった。