モデル dinucleosomeを用いたクロマチンを介した転写調節機構の解析

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近年、転写調節因子の中に、SWI/SNIF複合体のようにクロマチンの構造変化に関与するものや、p300/CBPあるいはRbp3pのようにヒストンのアセチル化および脱アセチル化の活性を有している因子が見つかってきた。これらにより転写調節機構解明に向けた転写因子からの研究と遺伝子のクロマチン構造からの研究がまさに交差し合うようになった。そこで、in vitroでクロマチン鋳型を用いて転写因子と転写活性さらにクロマチン構造を併せて解析することが可能な2つのポジショニングしたヌクレオソームからなる極めて単純なクロマチン鋳型、dinucleosomeの系を改良し、以下の3点について、研究に取り組んだ。1、アセチル化の程度の異なるヒストンをHaLa細胞から調整し、dinucleosomeを再構成して構造比較を5つの方法で行った(2次元アクリルアミドゲルを用いたヌクレオソーム移動性解析、ヌクレアーゼ消化速度によるヌクレオソーム安定性解析,ヌクレオソームポジション解析、xydrozylradical footprinting、アガロースゲルを用いたリンカーヒストンの結合解析)。その結果アセチル化による構造の変化は何も検出されなかった。しかしXenopus oocyte核抽出液を用いたin vitroの転写では、アセチル化により5S遺伝子の転写が活性化された。2、ビオチン標識したオリゴプローブを用いてPCRでDNA断片を増幅し、non-RIのdinucleosomeを作製し、原子間力顕微鏡によるdinucleosomeの構造解析を行った。3、dinuclelsomeの一方の5S遺伝子のプロモーターにSP6のプロモーターを挿入して5S遺伝子のプロモーターを破壊し、2種類の異なるRNA polymeraseで転写される遺伝子を1つずつ含む新しいDNA鋳型を作製した。