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培養神経細胞を用いたシナプス再形成・機能修復実験系の分子機構解明

利用培养神经元阐明突触再生和功能修复实验系统的分子机制

基本信息

批准号：
11157233
负责人：
黒田洋一郎
金额：
$ 0.83万
依托单位：
Tokyo Metropolitan Organization for Medical Research
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (A)
财政年份：
1999
资助国家：
日本
起止时间：
1999 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

神経細胞死に関連したシナプスの脱落は、神経系の機能障害を理解する上で重要であり、脱落後のシナプス再形成機構の解析は、神経機能の修復すなわち治療への応用にも意義があると考えられる。この機能回復の実態を細胞・分子レベルで明らかにするために、大脳皮質などの中枢培養神経細胞を用いた実験系、ことに培養系でのシナプスの脱落と再形成を可視化して観察するシステムについて検討した。シナプスの変化を可視化する解析法として、シナプスに局在するマーカー蛋白質に対する抗体を用いた免疫細胞染色を行い、共焦点レーザー走査顕微鏡観察と高精細3次元画像構築ソフト・IMARISなどを用いて、シナプスレベルでの形態的変化の観察を試みた。いずれの抗体によっても、ニューロンの細胞体、樹状突起上などにシナプス様の細かい粒状の染色像が観察され、中枢神経細胞培養系内で、多数のシナプスが成形されていることが可視化できた。用いる抗体により、例えば、興奮性シナプスについては抗NMDA受容体抗体、抑制性シナプスについては、抗GABA_A受容体抗体や抗Glutamic Acid Decarboxylase(GAD)抗体などを用いることにより、興奮性、抑制性のシナプスを個別に観察したり、シナプス前と後シナプスを別々に観察することが可能となった。さらに、三次元構築した共焦点画像を、IMARISを用いて処理加工した。これまでの共焦点レーザー顕微鏡観察でも、ニューロンの細胞体、樹状突起上に分布するシナプスを捉えることができたが、画像解析ソフトを用い、染色像を360度回転させることにより、理論上は、あるニューロンに存在する全てのシナプスが観察可能であり、シナプスの詳細な位置関係や形状なども調べることが可能となった。このシステムを用いることで、培養ニューロン間に形成されたシナプスの形態・数そしてその変化などを、電子顕微鏡を用いるのよりもはるかに簡便かつ詳細に追跡できる可能性がある。さらに、薬剤処理や損傷を与えた後のシナプスの脱落・修復過程を経時的に追跡したり、定量的に評価したりすることも可能であり、応用として、シナプスに障害を与えたり修復を促進するような因子の選別も容易に行えると思われる。

It is important to understand the relationship between neuronal cell death and detachment, and the functional impairment of the nervous system. It is important to analyze the mechanism of neuronal regeneration after detachment, and the significance of therapeutic effects on the restoration of neurological functions. The functional recovery of cells and molecules in the central culture of neurons in the brain and cortex is visualized in the culture system and the shedding and re-formation of cells in the culture system. The analysis method for visualization of the protein in the sample was carried out by immunocyte staining, confocal scanning, microscopic observation, and high-resolution three-dimensional image construction. In the middle of the cell body of the antibody, the dendritic process, the granular staining image, the central nervous system cell culture system, the majority of the morphological changes, the visualization. Antibodies such as anti-NMDA receptor antibodies, inhibitory receptor antibodies, anti-GABA_A receptor antibodies, and anti-Glutamic Acid Decarboxylase(GAD) antibodies are used to detect the effects of different types of antibodies, such as excitatory and inhibitory receptor antibodies. Three dimensional construction of confocal images, IMARIS processing Microscopic observation of the confocal point of the cell body, the distribution of the dendritic process, the use of the image analysis, the 360-degree rotation of the stained image, the theoretical analysis of the existence of the whole process, the detailed positional relationship, the shape of the adjustment, the possibility of the analysis. The possibility of using electron microscope to trace the trace in detail is discussed. For example, if you want to use the software, you can use the software to make it easy to select the factors that can be used to improve the quality of the software.