In vitro遺伝子ノックアウトによる細胞周期制御分子の機能解析

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ニワトリBリンパ細胞株DT40は、高等真核細胞で唯一ターゲットインテグレーションが高頻度に起こる細胞であり、本細胞を用いることにより特定の遺伝子をin vitroで破壊し、その機能を詳細に解析することが可能である。私達は酵母においてサイクリンA及びサイクリンBの分解に機能する分子である。HCT1(ショウジョウバエのホモログはfizzy-related(fzr)と呼ぶ)遺伝子のトリホモログのノックアウトを行い、高等真核細胞における機能について解析することを本研究計画の目的とした。本年度の成果を要約すると:1)HCT1/fzrのトリホモログのcDNAおよびゲノムDNAのクローニングを行った。2)DT40細胞においてHCT1/fzr遺伝子の破壊を行ったところ、G1期に本来検出できない分裂期サイクリン(サイクリンA、サイクリンB)が高く発現していることが認められた。DT40野生株はG1サイクリンの特異的阻害分子であるp27を発現させるとG1期で停止するのに対し、変異株ではS期に突入することが認められ、分裂期サイクリンの不定期発現(unscheduled expression)は細胞周期の制御異常を来たすことが分かった。更に、このHCT1/fzr遺伝子破壊株にヒトh-fzr遺伝子を強制発現したところG1期においても分裂期サイクリンが検出されなくなり、p27発現によってG1期に停止した。