蛋白発現ライブラリーを用いた腸内細菌に対する抗微生物蛋白同定の試み

尝试使用蛋白质表达库识别针对肠道细菌的抗菌蛋白质

基本信息

  • 批准号:
    11877204
  • 负责人:
  • 金额:
    $ 1.28万
  • 依托单位:
  • 依托单位国家:
    日本
  • 项目类别:
    Grant-in-Aid for Exploratory Research
  • 财政年份:
    1999
  • 资助国家:
    日本
  • 起止时间:
    1999 至 无数据
  • 项目状态:
    已结题

项目摘要

1.腸内細菌導入モデル大腸上皮のcDNAライブラリーの確立IQI無菌マウスに腸内細菌を導入し3日間経過した通常化マウス、同型のICR strainで通常環境下で飼育したSPFマウス、30匹より大腸、小腸上皮細胞を分離、ライブラリーを作成した。当初、subtractive libraryを作成する予定であったが、十分なタイターが得られず通常のcDNAライブラリー作成に変更した。蛋白発現効率の点からNot I-Sal Iアームを用い、λZIPLOXに組み込んだ。形質転換後のタイターは、通常化マウス大腸6.1x102/μl、SPFマウス大腸19x103/μl、小腸2.9x102/μlであった。インサートサイズはし2kb前後で、3x105クローンをライブラリー増幅に用い、増幅後のタイターは6x107/μlであった。2.Antibacterial proteinのスクリーニングファージ(1x104)をプレートに播き、通常の発現スクリーニングに従いIPTGにより蛋白発現させたニトロセルロース膜をLBプレートにのせ、上にソフトアガーに希釈した大腸菌XL-1Blue strainを注ぎ培養した。クーマシーブルーにより染色し、大腸菌増殖抑制効果を有するクローンをスクリーニング中である。3.今後の方向性最小限の目標である通常化マウスの大腸上皮細胞よりcDNAライブラリーを作成するという目標は達成した。このライブラリーは、Differential DisplayやcDNA microarrayで拾い上げた未知遺伝子のクローニングに活用される。Antibacterial peptideのスクリーニングについては、この系で大腸菌増殖抑制効果を有するpositive control cloneがないこと、subtract libraryでないことからスクリーニング効率が悪いなどの問題がある。
1. Intestinal bacteria introduced into the colon epithelium cDNA library to establish IQI sterile culture medium Intestinal bacteria introduced into the 3 day normal culture medium, isotype ICR strain cultured in normal environment SPF culture medium, 30 days large intestine and small intestine epithelial cells isolated, library to prepare. The original, subtractive library was created in advance, and the original cDNA library was created in advance. The protein discovery rate is Not I-Sal-I, λ ZIPLOX, λZIPLOX, λZIPLOX. After the change of shape and quality, it is usually changed to 6.1x102/μl for large intestine, 19x103/μl for SPF large intestine and 2.9x102/μl for small intestine. 3x105 ° C ° C ° C 2. Antibacterial protein protein development in the presence of IPTG (1x104) is usually associated with the development of E. coli XL-1Blue strain. Coliform growth inhibition effect. 3. In the future, the goal of orientation minimization is to achieve the goal of normalization of colorectal epithelial cells. The Differential Display and cDNA microarray are used to detect unknown genes. Antibacterial peptide has positive control clone and subtractive library.

项目成果

期刊论文数量(1)
专著数量(0)
科研奖励数量(0)
会议论文数量(0)
专利数量(0)
福島 浩平: "腸内細菌に対する生体防御機構"消化器と免疫. 36. 15-17 (1999)
Kohei Fukushima:“针对肠道细菌的生物防御机制”胃肠道和免疫学 36. 15-17 (1999)。
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