蛋白発現ライブラリーを用いた腸内細菌に対する抗微生物蛋白同定の試み

1.腸内細菌導入モデル大腸上皮のcDNAライブラリーの確立IQI無菌マウスに腸内細菌を導入し3日間経過した通常化マウス、同型のICR strainで通常環境下で飼育したSPFマウス、30匹より大腸、小腸上皮細胞を分離、ライブラリーを作成した。当初、subtractive libraryを作成する予定であったが、十分なタイターが得られず通常のcDNAライブラリー作成に変更した。蛋白発現効率の点からNot I-Sal Iアームを用い、λZIPLOXに組み込んだ。形質転換後のタイターは、通常化マウス大腸6.1x102/μl、SPFマウス大腸19x103/μl、小腸2.9x102/μlであった。インサートサイズはし2kb前後で、3x105クローンをライブラリー増幅に用い、増幅後のタイターは6x107/μlであった。2.Antibacterial proteinのスクリーニングファージ(1x104)をプレートに播き、通常の発現スクリーニングに従いIPTGにより蛋白発現させたニトロセルロース膜をLBプレートにのせ、上にソフトアガーに希釈した大腸菌XL-1Blue strainを注ぎ培養した。クーマシーブルーにより染色し、大腸菌増殖抑制効果を有するクローンをスクリーニング中である。3.今後の方向性最小限の目標である通常化マウスの大腸上皮細胞よりcDNAライブラリーを作成するという目標は達成した。このライブラリーは、Differential DisplayやcDNA microarrayで拾い上げた未知遺伝子のクローニングに活用される。Antibacterial peptideのスクリーニングについては、この系で大腸菌増殖抑制効果を有するpositive control cloneがないこと、subtract libraryでないことからスクリーニング効率が悪いなどの問題がある。

1.腸内細菌導入モデル大腸上皮のcDNAライブラリーの確立IQI無菌マウスに腸内細菌を導入し3日間経過した通常化マウス、同型のICR strainで通常環境下で飼育したSPFマウス、30匹より大腸、小腸上皮細胞を分離、ライブラリーを作成した。当初、subtractive libraryを作成する予定であったが、十分なタイターが得られず通常のcDNAライブラリー作成に変更した。蛋白発現効率の点からNot I-Sal Iアームを用い、λZIPLOXに組み込んだ。形質転換後のタイターは、通常化マウス大腸6.1x102/μl、SPFマウス大腸19x103/μl、小腸2.9x102/μlであった。インサートサイズはし2kb前後で、3x105クローンをライブラリー増幅に用い、増幅後のタイターは6x107/μlであった。2.Antibacterial proteinのスクリーニングファージ(1x104)をプレートに播き、通常の発現スクリーニングに従いIPTGにより蛋白発現させたニトロセルロース膜をLBプレートにのせ、上にソフトアガーに希釈した大腸菌XL-1Blue strainを注ぎ培養した。クーマシーブルーにより染色し、大腸菌増殖抑制効果を有するクローンをスクリーニング中である。3.今後の方向性最小限の目標である通常化マウスの大腸上皮細胞よりcDNAライブラリーを作成するという目標は達成した。このライブラリーは、Differential DisplayやcDNA microarrayで拾い上げた未知遺伝子のクローニングに活用される。Antibacterial peptideのスクリーニングについては、この系で大腸菌増殖抑制効果を有するpositive control cloneがないこと、subtract libraryでないことからスクリーニング効率が悪いなどの問題がある。