超機能性合成オリゴヌクレオチドによる特定遺伝子の転写制御法の開発

使用超功能合成寡核苷酸开发特定基因的转录控制方法

基本信息

批准号：
11877395
负责人：
今西武
金额：
$ 1.41万
依托单位：
Osaka University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Exploratory Research
财政年份：
1999
资助国家：
日本
起止时间：
1999 至 2000
项目状态：
已结题

项目摘要

一般に、三重鎖核酸の形成は標的二重鎖DNAがホモプリン-ホモピリミジン配列の場合に限定され、これがアンチジーン法の一般化・実用化を大きく妨げている.申請者らは、これまでにアンチジーン法によるDNAレベルでの遺伝子発現制御に向けた新しい核酸類縁体2'-O,4'-C-methylene bridged nucleic acid(2',4'-BNA)の合成に成功している。今回、このBNAの標的DNAに対する三重鎖形成能を詳細に評価したところ、BNAが極めて高い三重鎖形成能を有すること、その三重鎖形成は配列特異的であること等の興味深い知見が得られた。さらに、このBNAに新たな核酸塩基を導入し、これまでは極めて困難とされてきたCG塩基対をHoogsteen型水素結合にて認識可能かどうかという点について検討を進めた。合成した新規BNA類縁体については、各種スペクトル解析(NMR、X線結晶解析)によって、その糖部立体配座が厳密にN型に固定化されていることを確認した。さらに、これら新規BNA類はアミダイト化した後、DNA合成機を用いオリゴヌクレオチドへ導入した。新規BNAを含むオリゴヌクレオチド類について、その三重鎖形成能をTm測定により評価したところ、三重鎖形成が困難であるとされている中性条件下においても、CG塩基対を極めて効果的に認識し、安定な三重鎖核酸を形成し得ることを見出した。本結果は今後のアンチジーン法の開発研究にとって非常に重要な意味を持つものである。

通常，三链核酸的形成仅限于目标双链DNA是同孕型 - 摩pyrimidine序列的情况，这极大地阻碍了抗基因方法的概括和实际应用。申请人成功合成了一种新的核酸类似物，2'-O，4'-C-甲基桥接的核酸（2'，4'-BNA），旨在使用抗基因方法在DNA水平上控制基因表达。在这项研究中，我们获得了有趣的发现，例如BNA与目标DNA形成三链的能力，目标DNA具有极高的三重链形成能力，而Triplex形成是特定于序列的。此外，将新的核碱基引入了该BNA中，并进行了研究，该研究是对CG基碱对是否非常困难的，可以通过Hoogsteen型氢键识别。通过各种光谱分析（NMR，X射线晶体学）证实了合成的新型BNA类似物，以确保将糖构象严格固定在N型中。此外，这些新型BNA被氨化，然后使用DNA合成器将其引入寡核苷酸。当通过TM测量评估含有新型BNA的寡核苷酸的三核苷酸的能力时，也发现即使在困难的三层形成的中性条件下，CG碱基对也可能非常有效，并且可以形成稳定的三核酸。这些结果对未来对反基因方法的研究具有极为重要的意义。