DNA修復関連因子を利用したDNA損傷検出系の開発

利用DNA修复相关因素开发DNA损伤检测系统

• 批准号: 11878091
• 负责人: 松永 司
• 金额: $ 1.34万
• 依托单位: Kanazawa University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Exploratory Research
• 财政年份: 1999
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1999 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-11878091/
• 关键词: DNA損傷; モノクローナル抗体; キャピラリー電気泳動; ヌクレオチド除去修復; 紫外線

1)リコンビナント修復関連因子の調製と各因子に対するモノクローナル抗体の作製当初、本研究で使用する修復関連因子としてDNA末端に結合するKu抗原、ミスマッチ塩基対に結合するMutS、バブルやループ構造に特異的に切断を入れるXPGやXPF-ERCCI等を想定したが、今年度はXPG,XPF-ERCC1に加えて、ヌクレオチド除去修復のDNA損傷結合因子であるXPA、XPC-hHR23Bをリコンビナントタンパクとして調製した(MutSは市販)。XPA以外は全てバキュロウィルス/昆虫細胞高発現系を利用し、XPA、XPF、ERCC1にはヒスチジン(His)のタグを付けた。一方、各因子に対するモノクローナル抗体は、抗XPGと抗ERCC1抗体(2種ずつ)を昨年度までに、抗XPA(3種)と抗XPC(1種)抗体を今年度新たに樹立した(抗His抗体は市販)。2)キャピラリー電気泳動法を用いたDNA損傷検出系の開発本研究では、修復関連因子とそれらに対する特異抗体、ならびにキャピラリー電気泳動装置を利用したDNA損傷検出系の開発を目指した。そこでまず、これまでに作製したシクロブタン型ピリミジン二量体に対するTDM-2モノクローナル抗体を利用して条件設定を試みた。紫外線(0-10J/m^2)を照射された細胞から抽出したDNA(熱変性したもの)をTDM-2抗体、Alexa^<TM>488で標識された抗マウスIgG(H+L)2次抗体と反応させた後、ノンコテーィリングシリカキャピラリーで分離した。488nmのアルゴンイオンレーザーで2次抗体の蛍光を検出したところ、DNA-TDM-2抗体-2次抗体の複合体に由来すると思われるピークが検出され、その面積は紫外線線量に依存して増加した。本年度は抗体を用いた予備実験しかできなかったが、キャピラリー電気泳動法を用いてDNA損傷を検出できる見通しが立ったため、今後は調製した各種修復関連因子と抗体を利用することにより、様々なDNA損傷の検出系へと応用していく予定である。

1) リ コ ン ビ ナ ン ト repair masato even factor の modulation と each factor に す seaborne る モ ノ ク ロ ー ナ ル antibody の system at the beginning, this study use で す る repair masato even factor と し て DNA end に combining す る Ku antigens, ミ ス マ ッ チ salt base に seaborne combining す る than, バ ブ ル や ル ー プ tectonic に specific に cut を into れ る XPG や XPF - E RCCI を し scenarios such as た が, our は XPG, XPF - ERCC1 に plus え て, ヌ ク レ オ チ ド removal of DNA damage repair の combination factor で あ る XPA, XPC - hHR23B を リ コ ン ビ ナ ン ト タ ン パ ク と し て modulation し た (than は city vendor). XPA は beyond all て バ キ ュ ロ ウ ィ ル ス / insect cells high 発 now を using し, XPA, XPF, ERCC1 に は ヒ ス チ ジ ン (ihs) の タ グ を pay け た. Side, each factor に す seaborne る モ ノ ク ロ ー ナ は ル antibody, XPG と ERCC1 antibody resistance (two ず つ) を yesterday annual ま で に, resistance to others (3) と XPC resistance (1) antibody を our new た に set し た (ihs antibody は city vendor). 2) the キ ャ ピ ラ リ ー 気 swimming method を with い た DNA damage 検 out started の 発 this study で は, repair masato even factor と そ れ ら に す seaborne る specific antibodies, な ら び に キ ャ ピ ラ リ ー 気 swimming devices を using し た DNA damage 検 out started の 発 を refers し た. そ こ で ま ず, こ れ ま で に cropping し た シ ク ロ ブ タ ン type ピ リ ミ ジ ン 2 quantity body に す seaborne る TDM - 2 モ ノ ク ロ ー ナ ル antibody を using し て conditions set を try み た. Ultraviolet (0 to 10 j/m ^ 2) を irradiation さ れ た cells か ら spare し た DNA (hot - し た も の) を TDM - 2 antibodies, Alexa ^ > < TM 488 で logo さ れ た resistance マ ウ ス IgG antibody と (H + L) 2 times against 応 さ せ た, ノ ン コ テ ー ィ リ ン グ シ リ カ キ ャ ピ ラ リ ー で separation し た. 488 nm の ア ル ゴ ン イ オ ン レ ー ザ ー で two antibodies の 蛍 light を 検 out し た と こ ろ, DNA - TDM - 2-2 times の antibodies complex に origin す る と think わ れ る ピ ー ク が 検 out さ れ, そ の area は ultraviolet radiation dose に dependent し て raised plus し た. This year を は antibody with い た reserve be 験 し か で き な か っ た が, キ ャ ピ ラ リ ー 気 swimming method を with い て DNA damage を 検 out で き る see tong し が made っ た た め, future は modulation し た various repair masato even factor と antibody を using す る こ と に よ り, others 々 な DNA damage の 検 out department へ と 応 with し て い く designated で あ る.

项目成果

Ohtoshi,E.: "Respective roles of cyclobutane pyrimidine dimers, (6-4)photoproducts and minor photoproducts in UV mutagenesis of repair deficient xeroderma pigmentosum A cells."Cancer Res.. (in press). (2000)

Ohtoshi,E.：“环丁烷嘧啶二聚体、(6-4)光产物和次要光产物在修复缺陷性着色性干皮病 A 细胞的紫外线诱变中的各自作用。”Cancer Res..（出版中）。

Harada,Y.-N: "Postnatal growth failure, short life span, and early onset of cellular senescence and subsequent immortalization in mice lacking the xeroderma pigmentosum group G gene."Mol.Cell.Biol.. 19(3). 2366-2372 (1999)

Harada,Y.-N：“缺乏着色性干皮病 G 组基因的小鼠出生后生长障碍、寿命短、细胞衰老提前以及随后的永生化。”Mol.Cell.Biol.. 19(3)。

Kobayashi,H.: "Probing the interaction between a high-affinity single-chain Fv and a pyrimidine (6-4) pyrimidone photodimer by site-directed mutagenesis."Biochemistry,. 38(2). 532-539 (1999)

Kobayashi,H.：“通过定点诱变探索高亲和力单链 Fv 和嘧啶 (6-4) 嘧啶酮光二聚体之间的相互作用。”生物化学，。

Torizawa,T.: "DNA binding mode of the Fab frangment of a monoclonal anitibody specific for cyclobutane pyrimidine dimer."Nucleic Acids Res.. 28(4). 944-951 (2000)

Torizawa,T.：“环丁烷嘧啶二聚体特异性单克隆抗体 Fab 片段的 DNA 结合模式。”《核酸研究》28(4)。