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DNA修復関連因子を利用したDNA損傷検出系の開発

利用DNA修复相关因素开发DNA损伤检测系统

基本信息

批准号：
11878091
负责人：
松永司
金额：
$ 1.34万
依托单位：
Kanazawa University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Exploratory Research
财政年份：
1999
资助国家：
日本
起止时间：
1999 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

1)リコンビナント修復関連因子の調製と各因子に対するモノクローナル抗体の作製当初、本研究で使用する修復関連因子としてDNA末端に結合するKu抗原、ミスマッチ塩基対に結合するMutS、バブルやループ構造に特異的に切断を入れるXPGやXPF-ERCCI等を想定したが、今年度はXPG,XPF-ERCC1に加えて、ヌクレオチド除去修復のDNA損傷結合因子であるXPA、XPC-hHR23Bをリコンビナントタンパクとして調製した(MutSは市販)。XPA以外は全てバキュロウィルス/昆虫細胞高発現系を利用し、XPA、XPF、ERCC1にはヒスチジン(His)のタグを付けた。一方、各因子に対するモノクローナル抗体は、抗XPGと抗ERCC1抗体(2種ずつ)を昨年度までに、抗XPA(3種)と抗XPC(1種)抗体を今年度新たに樹立した(抗His抗体は市販)。2)キャピラリー電気泳動法を用いたDNA損傷検出系の開発本研究では、修復関連因子とそれらに対する特異抗体、ならびにキャピラリー電気泳動装置を利用したDNA損傷検出系の開発を目指した。そこでまず、これまでに作製したシクロブタン型ピリミジン二量体に対するTDM-2モノクローナル抗体を利用して条件設定を試みた。紫外線(0-10J/m^2)を照射された細胞から抽出したDNA(熱変性したもの)をTDM-2抗体、Alexa^<TM>488で標識された抗マウスIgG(H+L)2次抗体と反応させた後、ノンコテーィリングシリカキャピラリーで分離した。488nmのアルゴンイオンレーザーで2次抗体の蛍光を検出したところ、DNA-TDM-2抗体-2次抗体の複合体に由来すると思われるピークが検出され、その面積は紫外線線量に依存して増加した。本年度は抗体を用いた予備実験しかできなかったが、キャピラリー電気泳動法を用いてDNA損傷を検出できる見通しが立ったため、今後は調製した各種修復関連因子と抗体を利用することにより、様々なDNA損傷の検出系へと応用していく予定である。

1) Modulation of Repair-Related Factors and Related Factors in the Production of Antibodies In this study, we used Repair-Related Factors to bind Ku Antigen to DNA Terminals, MutS to bind Ku Antigen to DNA Terminals, XPG to XPF-ERCC1 to bind Ku Antigen to DNA Terminals, MutS to bind Ku Antigen, MutS to DNA Terminals, MutS to bind Ku Antigen to DNA Terminals, MutS to bind XPG, XPF-ERCC1 to construct Specific Cut-XPC-hHR23B can be controlled by MutS. In addition to XPA, all high-discovery systems in Baka Kurokusu/insect cells can be utilized. XPA, XPF, and ERCC1 are also working on the development of the gene (His). Antibodies against XPG and ERCC1 (2 types) were newly established in the past year, anti-XPA (3 types) and anti-XPC (1 type) antibodies were newly established this year. 2) Development of DNA damage detection system using electrokinetic method. For example, if you want to use TDM-2, you can use TDM-2 to set the conditions for the use of TDM-2. After the cells were irradiated with ultraviolet rays (0-10J/m^2), the DNA(thermotropic) extracted from the cells was separated by TDM-2 antibody, Alexa^<TM>488 labeled anti-Mars IgG(H+L) secondary antibody and anti-virus. 488nm UV light source, DNA-TDM-2 antibody-2 antibody complex, the origin of the light source, the area of the UV light source is dependent on the increase. This year, the use of antibodies in the detection of DNA damage is expected to increase. In the future, the use of antibodies in the detection of DNA damage will increase.