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ヌクレオチド除去修復反応を調節する細胞内因子の解析

调节核苷酸切除修复反应的细胞内因子分析

基本信息

批准号：
09253215
负责人：
松永司
金额：
$ 1.92万
依托单位：
Kanazawa University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
1997
资助国家：
日本
起止时间：
1997 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

近年、高度に精製されたタンパクを用いてヌクレオチド除去修復(NER)反応が試験管内で再構成された。単純化した試験管内系の特徴を生かして基本的NER反応の詳細な作用機構を解明していく一方で、細胞内における他のDNA代謝機構との共存・協調のメカニズムや細胞内の様々なネットワークの中で働くための調節機構を明らかにする必要がある。本研究では、NER機構と相互作用し、基本的NER反応を正、あるいは負に調節する細胞内因子を同定・単離することを目的とした。本年度はまずアッセイ系の確立、および材料の調製を試みた。1.NERの試験管内アッセイ系をスクリーニング系として用いるために、^<32>P標識を必要としない非RIの簡便なアッセイシステムの開発を試みた。蛍光物質をDNA損傷と見立て特定部位に導入した基質DNAを用いることによって、RIで標識することなく損傷を直接蛍光で追跡することが可能となった。また、作製した基質DNAは長期保存が可能となり、再現性の高い系として期待される。問題点として、RIを使用した場合に比べて検出感度が劣ることが挙げられるが、現在基質DNAのデザインの改善などいくつかの改良を行っている。2.再構成系の確立のために、種々のNER因子をリコンビナントタンパクとして調製する必要があり、各遺伝子をバキュロウィルス/昆虫細胞発現用ベクターにサブクローニングし、最終的にリコンビナントウィルスを得た。現在までにXPG、XPA、XPF-ERCC1、およびXPC-hHR23Bが得られ、XPGはすでにリコンビナントタンパクとして精製された。3.各NER因子に対するモノクローナル抗体の樹立を目指し、まずMBP-XPG融合タンパクを免疫原としてマウスを免疫し、XPGに対するモノクローナル抗体4種を作製した。またERCC1とXPFに対するモノクローナル抗体の作製も現在進行している。

In recent years, highly refined materials have been used to remove repair (NER) materials and to reconstruct them in test tubes. To clarify the mechanism of DNA metabolism in one cell, to clarify the regulatory mechanism of DNA metabolism in another cell. This study focuses on the interaction between the two mechanisms, and on the regulation of intracellular factors. This year, we will try our best to establish and modulate the quality of our products. 1. Try to develop a simple system for the test tube<32>. The DNA damage caused by the photoactive substance can be directly traced to the substrate DNA. It is expected that long-term preservation of matrix DNA will be possible and reproducible. The problem is that when RI is used, the sensitivity of DNA is lower than that of DNA. 2. In order to establish the system, the inner factors of the species are required to be modulated, and the genes are required to be generated. XPG, XPA, XPF-ERCC1, XPC-hHR23B are now available, and XPG is now available for refinement. 3. Each NER factor is responsible for the production of four kinds of antibodies, namely MBP-XPG fusion protein, immunogen and XPG. ERCC1 and XPF are now in progress for the production of anti-ERCC antibodies.