除去修復エンドヌクレアーゼの機能とその欠損による分子病態に関する研究

切除修复核酸内切酶的功能及其缺陷引起的分子病理学研究

基本信息

  • 批准号:
    10165206
  • 负责人:
  • 金额:
    $ 1.34万
  • 依托单位:
  • 依托单位国家:
    日本
  • 项目类别:
    Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (A)
  • 财政年份:
    1998
  • 资助国家:
    日本
  • 起止时间:
    1998 至 无数据
  • 项目状态:
    已结题

项目摘要

ヌクレオチド除去修復(NER)において、XPGとXPF-ERCC1はそれぞれ損傷の3′側と5′側の切断酵素として働くが、XPGやERCC1をノックアウトしたマウスはいづれも成長阻害、離乳前死亡というNER欠損だけでは説明できない重篤な症状を示す。また、XPGはXPF-ERCC1による5′側切断にも関与している可能性が示唆されており、本研究ではXPGの除去修復エンドヌクレアーゼとしての機能以外の役割に注目した。1. Two-hybridシステムを用いた解析より、XPGとERCC1の相互作用が示唆された。プルダウンアッセイを用いて試験管内で確認したところ、バキュロウィルス高発現系から精製されたリコンビナントタンパクや試験管内転写/翻訳反応により合成されたタンパクで両者の相互作用が確認できた。また、その相互作用ドメインのマッピングを行い、XPGはN末とC末の2箇所(主にN末)にERCC1はN末の領域に特定できた。本研究で示されたXPGとERCC1との相互作用は、XPF-ERCC1の損傷部位へのリクルートに関与しているのかもしれない。2. XPGタンパクはNERとは別の修復機構である塩基除去修復(BER)にも関与する可能性が示唆されており、この点について検討した。まず、ウラシルを1個のみ含むDNA基質を用いて塩基除去修復の試験管内切断反応系を確立した。これを用いて各種細胞粗抽出液の切断活性を比較したところ、XP-G患者由来細胞や放医研の塩見らによって樹立されたxpgノックアウトマウス由来細胞の抽出液は、正常細胞に比べて常に低い切断活性(50-80%)を示すことがわかった。また、この低切断活性はウラシルDNAグリコシラーゼの反応効率の低下に起因していた。しかし、リコンビナントXPGを反応系に添加しても相補されず、XPGの塩基除去修復への関与は間接的なものであることが示唆された。
在核苷酸切除修复(NER)中,XPG和XPF-ERCC1分别充当损伤的3'和5'侧面的裂解酶,但是敲除XPG和ERCC1的小鼠均表现出严重的症状,例如出现生长抑制和预性死亡等严重症状,仅由NER独自降低了,这不能解释。还有人提出,XPG也可能参与XPF-ERCC1的5'裂解,在这项研究中,我们将重点放在功能以外的其他角色上,作为切除修复核酸酶。 1。使用两个杂交系统的分析表明XPG和ERCC1之间的相互作用。当使用下拉分析确认体外确认时,两者之间的相互作用在从杆状病毒高表达系统中纯化的重组蛋白与通过体外转录/翻译反应合成的蛋白质纯化。此外,对相互作用域进行了映射,并在两个位置鉴定了XPG,在N末端和C端(主要是N端)和N-terminus区域的ERCC1。这项研究中显示的XPG和ERCC1之间的相互作用可能参与招募XPF-ERCC1到损伤部位。 2。已经提出,XPG蛋白也可能参与与NER分开的修复机构的碱基切除修复(BER),并检查了这一点。首先,使用仅包含一个尿嘧啶的DNA底物建立了用于碱基切除修复的体外切割反应系统。使用此过程,我们比较了各种细胞原油提取物的裂解活性,发现源自Shiomi等人建立的XPG患者和细胞的细胞提取物。国家放射学研究所的裂解活性始终比正常细胞表现出更低的裂解活性(50-80%)。此外,这种低的切割活性归因于尿嘧啶DNA糖基化酶的反应效率降低。但是,在反应系统中添加重组XPG并没有补充反应,这表明XPG参与碱基切除修复是间接的。

项目成果

期刊论文数量(4)
专著数量(0)
科研奖励数量(0)
会议论文数量(0)
专利数量(0)
Ishigaki,Y.: "An UVB-carcinogenesis model with KSN nude mice." J.Radiat.Res.39. 73-81 (1998)
Ishigaki,Y.:“KSN 裸鼠的 UVB 致癌模型。”
  • DOI:
  • 发表时间:
  • 期刊:
  • 影响因子:
    0
  • 作者:
  • 通讯作者:
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Kobayashi,N.:“核上黑色素帽可减少人类表皮中紫外线诱导的 DNA 光产物。”
  • DOI:
  • 发表时间:
  • 期刊:
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    0
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  • 通讯作者:
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