ツメガエル卵を用いた新規Wee1キナーゼおよびPrkキナーゼの機能解析

使用非洲爪蟾卵对新型 Wee1 激酶和 Prk 激酶进行功能分析

基本信息

批准号：
00J00762
负责人：
岡本健吾
金额：
$ 1.92万
依托单位：
Kyushu University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2000
资助国家：
日本
起止时间：
2000 至 2002
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-00J00762/
关键词：
細胞周期アフリカツメガエル Wee1 Cdc2 MPF

项目摘要

細胞の分裂・増殖は、G1/S/G2/M期からなる細胞周期を通じておこる。なかでもG2期からM期への進行はCdc2/サイクリンB複合体であるM期促進因子(MPF)による制御を受けている。Wee1キナーゼはCdc2のTyr15残基をリン酸化することでMPFの負の制御因子として働いている。脊椎動物にはWee1が二種類存在し、母性型Wee1(Wee1A)と胚性型Wee1(Wee1B)とがある。これらのアイソフォームは互いに分解制御機構・活性制御機構が異なることで、初期発生過程における細胞周期様式の変遷に対応している。一般にWee1はN末端側に長い調節領域(N-terminal regulatory domain ; NRD)を有する。Wee1BのNRD(240a.a.)を段階的に欠失した変異体を作成しそれらのM期進行阻害活性を比較した結果、NRD中央40a.a.の欠失変異体において阻害活性が著しく低下することが分かった。この事より、Wee1BのNRDの中央には活性制御領域が存在することが示唆された。興味深いことに、この領域にはWee1Aや他種のWee1でも高度に保存されている部位が2つ近接して存在していた。そこで、その保存された2つの部位をそれぞれAla置換したWee1B変異体を作成し、阻害活性を比較した。その結果、一方の変異体では阻害活性が上昇したのに対して、もう一方の変異体では阻害活性が著しく低下した。またin vitroの系による解析から、阻害活性が低下した変異体においてはWee1の基質であるMPFとの結合能が低下することが分かった。この事より、この部位が基質認識に重要な役割を担っていることが示唆された。以上の結果より、Wee1のN末端側調節領域には正と負の両方の調節部位が近接して存在することが初めて示された。

细胞分裂和增殖发生在整个细胞周期中，由G1/S/G2/M相组成。特别是，从G2到M相的进展由M相启动子（MPF）（A CDC2/Cyclin B复合物）调节。 WEE1激酶通过CDC2中Tyr15残基的磷酸化作为MPF的负调节剂。脊椎动物中有两种类型的WEE1：母体类型WEE1（WEE1A）和胚胎型WEE1（WEE1B）。这些同工型在降解和活性控制机制方面有所不同，并且与早期发育过程中细胞周期模式的变化相对应。通常，WEE1具有长的N末端调节域（NRD）。生产WEE1B NRD（240A.A.），并比较了分阶段缺失的突变体，并比较了其M期进展抑制活性，并发现Central 40A.A. A的缺失突变体中的抑制活性显着降低。 nrd。这表明在WEE1B的NRD中心存在一个主动调节区域。有趣的是，在WEE1A和其他WEE1的其他物种中，还发现了该地区的两个高度保守的地点。因此，我们创建了WEE1B突变体，其中两个保守的位点被ALA取代，并比较了它们的抑制活性。结果，一个突变体中的抑制活性增加，而另一个突变体中抑制活性显着降低。此外，使用体外系统的分析表明，在抑制活性降低的突变体中，MPF的结合能力（WEE1的底物）被降低。这表明该站点在底物识别中起着重要作用。上述结果首次表明，在WEE1的N末端调节区域中，正面和负调控位点近距离存在。