単同位体化DNAを用いた分子病解析

使用单同位素 DNA 进行分子疾病分析

基本信息

批准号：
00J01936
负责人：
金子理奈
金额：
$ 1.92万
依托单位：
Osaka University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2000
资助国家：
日本
起止时间：
2000 至 2002
项目状态：
已结题

项目摘要

一酸化窒素(NO)は血管平滑筋の拡張をはじめ、アポトーシスの制御及び免疫応答といった多くのはたらきを有する分子である。NOがタンパク質のチオール基と結合したS-ニトロソ化タンパク質はこれらの作用発揮に関与する重要な翻訳後修飾分子である。現在までにヘモグロビンやカスパーゼなどがS-ニトロソ化されているという報告がある。S-ニトロソ化タンパク質の検出法としては従来、化学発光法やジアゾカップリング法が用いられていたが、これらはS-NOの結合を切断し、遊離したNOを定量する手法であるため、修飾タンパク質に関する情報(どのタンパク質のどのシステイン残基にどの程度)を得ることができない。以上の理由で、翻訳後修飾の直接検出に有効な質量分析法を用いて、実験を行った。結果:1.エレクトロスプレーイオン化(ESI)を用いてS-ニトロソ化を検出することができたが、ノズル電圧を上げることでNOの脱離が起こるため、定量的解析には最小のノズル電圧を用いることが必要である。定量的解析ができているか判断するには、それぞれの多価イオンについてS-ニトロソ化イオンと非修飾イオンの量比を比べ、差がなければよい。2.マトリックス支援レーザー脱離イオン化(MALDI)では、S-ニトロソ化イオンは全く検出されず、NO脱離の後にマトリックス分子などから水素を獲得し、還元されることがわかった。脱離のメカニズムはまだ未解明であるが、S-ニトロソ化合物由来の吸収がない赤外波長のレーザーを用いても同様の結果だったことより、共鳴吸収によるものではないと考えられた。3.高速原子衝撃(FAB)では、S-ニトロソ化イオンは一部残存するが、残りはNO脱離及び還元されることがわかった。以上のことより、S-ニトロソ化の定量的検出にはESI法を用いることが必要で、しかもノズル電圧は最小に抑えなければならないということが判明した。

一氧化氮（NO）是具有许多功能的分子，包括血管平滑肌的扩展，凋亡的控制和免疫反应。 S-硝化蛋白在蛋白质的硫醇群中没有任何附着的蛋白是参与其作用的重要后翻译后修饰剂。迄今为止，已经有报道称血红蛋白和caspase已被S-硝化。通常，已使用化学发光和重氮耦合方法来检测S-硝化蛋白，但是由于这些方法用于打破S-NO的键并量化免费的NO，因此无法获得有关修饰蛋白的信息（在多大程度上，任何蛋白质的氰基残基）无法获得。由于上述原因，使用质谱法进行了实验，这对于直接检测到翻译后修饰是有效的。结果：1。电喷雾电离（ESI）可用于检测S-硝化化，但是由于在增加喷嘴电压时不会发生解吸，因此有必要使用最小喷嘴电压进行定量分析。为了确定是否可能进行定量分析，应比较每个多价离子的S-硝化离子和未修饰离子的量比，没有差异。 2。在基质辅助激光解离电离（MALDI）中，未检测到S-硝化离子，并从基质分子等无解吸后获得氢，并减少了氢。解吸机制仍然未知，但是当使用未从S-硝基化合物吸收的红外波长的激光器时，观察到了相同的结果，因此认为这不是由于谐振的吸收。 3。发现某些S-硝化离子仍处于高速原子轰击（FAB）中，但其余的是吸引和减少的。从上面可以发现，ESI方法对于定量检测S-硝化作用是必需的，并且必须将喷嘴电压保持在最低限度。