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一分子生理学の立ち上げ:一個の分子機械の機能と構造変化の直接観察

推出单分子生理学：直接观察单分子机器的功能和结构变化

基本信息

批准号：
12002012
负责人：
木下一彦
金额：
$ 347.01万
依托单位：
National Institutes of Natural Sciences Okazaki Research Facilities (2004)Okazaki National Research Institutes (2001-2003)Keio University (2000)
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Specially Promoted Research
财政年份：
2000
资助国家：
日本
起止时间：
2000 至 2004
项目状态：
已结题

项目摘要

本研究は、新規課題の採択に伴い2004年6月14日をもって廃止することとなった。以下は、この時点までの研究実績である。未完成部分の多くは、新規課題に取り込んで完成させていく予定である。1.F1-ATPaseの回転機構昨年度、磁気ピンセットを用いたF1-ATPaseの強制逆回転によるATP合成を報告したが、定量性にはまだまだ周題が多い。本来1回転に付き3個のATPができてもいいのだが、これまで一番よいデータでも2個程度にしかならなかった。一つの理由は、大きな磁気ビーズは抵抗が大きいため、ゆっくりしか回らないことにあった。そこで磁気ピンセットを改良し、磁力を上げたところ、同一回転速度においてより多くのATP合成が起きるようになった。また、ADP濃度を上げることも重要なことが分かってきた。現時点では実際に回転しているF1分子の数の見積もりにまだ大きな誤差があるため、1回転あたりの合成数に不確定さが残っているが、定量化の見通しが立ちつつある。F1の回転子であるγサブユニットの先端(F1の中に深く入り込んだ部分)を削っても回転にそれほどの支障がないという結果が他の研究室から出ているが、少なくとも我々の使っている好熱菌由来のF1の場合、さらに短く削ってしまってもちゃんと回転することが分かってきた。結晶構造からは、固定子サブユニット(α3β3の筒)との相互作用が示唆されている領域であり、意外な結果である。我々のF1の最高回転速度(ステップ中の瞬間速度でなく長時間にわたる平均速度)は毎分8000回転であることをすでに報告してあるが、これは室温(23度)でのものだった。好熱菌では至適温度が70度近辺なので、この温度に上げればもっと速く回る可能性がある。技術的な問題から回転の直接測定にはまだ成功していないが、加水分解活性の温度依存性の解析などから、70度における回転速度は室温の10倍をはるかに超えることが示唆された。一方低温側では回転が急速に遅くなり、全体として、回転機構には大きな温度依存性があるようである。F1の3つの結合部位に結合したヌクレオチドの数が1-2-1-…と変化しながら回転するのか(bi-site説)それとも2-3-2-3…なのか(tri-site説)、いまだに最終決着が付かないが、ATP加水分解速度のきちんとした解析から、bi-siteで全く活性がないという説(Seniorが提唱)は成り立ちそうもないことが分かりつつある。作業仮説として、実際のメカニズムはbi-siteとtri-siteの中間的な、結合ヌクレオチド数が常に2個である、というメカニズムを考えているが、ATP濃度にかかわらずこのメカニズムで回るのかどうか、まだ結論には至っていない。蛍光性ATPアナログや蛍光エネルギー移動を用いた研究を含め、様々な角度から実験的検討を進めている段階である。2.ミオシンVとミオシンVIの歩行機構2本足を使って歩くと考えられているミオシンVとミオシンVIの歩行機構につき研究を進めてきたが、昨年度は、ミオシンVより脚の短いミオシンVIのほうが歩幅が大きいという、一見矛盾する結果を報告した。他の研究室からミオシンVIの脚は実は長いという結果が出てきたので、我々の結果も基本的にはこれで説明できる。しかしミオシンVIの長い脚はおそらく柔らかく、後ろ向きに負荷がかかる状況では、従来提唱されてきた歩行機構に従えば逆行してしまうはずである。同様の問題を抱えたキネシンも含め、持ち上げた足の爪先の上げ下げが制御されるとすれば負荷に逆らった前進を説明できることを提唱した(爪先上下機構)。すなわち、爪先が下がっていれば後方でなく前方に着地しやすくなる(ヒトの歩行も同様)。従来のレバーアーム説は着地した方の足首の曲げのみに注目するが、持ち上げた足の足首の動きも同様に、あるいはそれ以上に、重要であるという説である。ミオシンVに関しては、歩行説を直接確かめるため、脚の動きを可視化する試みを始めた。これまでに、ラベルのための脚の遺伝的改変に成功した。

This study was completed on June 14, 2004 as a new project. The following は, この time points and までの research 実achi である. The unfinished parts have been completed, and the new tasks have been completed. 1.F1-ATPase's return mechanism last year, magnetic field F1-ATPa seのforced reverse 転によるATP synthesisをreportしたが、quantitativeにはまだまだweekly questionが多い. Originally, 1 round of 転にpayき3のATPができてもいいのだが, これまで一ichibanよいデータでも2 level にしかならなかった.一つのREASONは、大きなMagnetic気ビーズはresistant が大きいため、ゆっくりしか回らないことにあった. The same chapter転speedにおいてより多くのATP synthesisが开きるようになった. It is important that the concentration of ADP is higher than the concentration of ADP. The current point is the same as the current point. , 1 return of 転あたりのThe number of the synthesis is uncertain, the residual value is the same, and the quantitative analysis is done. F1's back to the wind child's head Part) を Cut the っても転にそれほどの support barrier がないという results がの Laboratoryから出ているが、小なくとも我々の使っている好热的综合のF1のoccasion , さらに Short and short, ってしまってもちゃんと回転することが分かってきた. Crystal structure, fixed element (α3β3 cylinder), interaction, and interaction, unexpected results, etc. My F1's maximum recovery speed (instantaneous speed in the middle and average speed over a long period of time) every minute 8000 times the report of 転であることをすでにしてあるが、これはroom temperature (23 degrees)でのものだった. Thermophilic bacteria can reach the optimal temperature of 70 degrees and can reach the optimal temperature of 70 degrees. Technical problems: direct measurement of the water content and the temperature dependence of the hydrolysis activity Analyze the speed of the 70 degree におけるは room temperature 10 times the をはるかに超えることが Show the instigation された. One side has a low-temperature side return switch, a rapid return switch, an overall return switch, and a large return switch on the low temperature side, and a temperature-dependent return switch. F1の3つのjoining siteにcombinationしたヌクレオチドのnumberが1-2-1-…と変化しながら回転するのか(bi-site said)それとも2-3-2-3…なのか(tri-site said)、いまだにFinal decision がpay かないが、ATP hydrolysis speed のきちんとしたanalysis から、bi-site で全くACTIVE がないという说(Seniorが提声)は成り立ちそうもないことが分かりつつある. Homework仮说として、実记のメカニズムはbi-siteとtri-siteの中な、combinationヌクレオチドnumberが oftenに2である, というメカニズムを卡えているが, ATP concentration にかかわらずこのメカニズムで回るのかどうか, まだ Conclusion には to っていない.荍光性 ATPアナログや荍光エネルギーmovable を用いた Research をContaining め、様々なangle から実的検曒进めているStep である. 2.ミオシンVとミオシンVIの歩行组2本足を使って歩くとResearch on the testing and management of the test systemを入めてきたが、Yesterday yearは、ミオシンVよりfootの小いミオシンV I am a large person, and I am a conflict at first sight and the result is a report. His laboratory's からミオシンVIのfoot and は実は长いというRESULTS が出てきたので, I 々のRESULTS にはこれで说できる.しかしミオシンVIの长い足はおそらくsoft らかく、Backward きにload がかかるThe situation is good, and the situation is good. Same as the problem of holding the same problem, holding the upper part of the foot and holding the upper part of the foot.るとすれば Load and reverse らったforward をExplanation できることをraise and sing した (claw first up and down mechanism).すなわち, claw first が下がっていれば rear でなくfront に touchdown しやすくなる (ヒトの歩行も同様).従来のレバーアーム说は地したsquareの足头の歌げのみに Gaze するが、hold ち上げThe foot of the foot is the same as the movement of the foot, the upper part of the foot is the same as the upper part of the foot, and the important part is the upper part of the foot.ミオシンVに关しては, 歩行说をDirect confirm かめるため, Feet moving きをVisualization するtest みをstart めた. The transformation of the これまでに、ラベルのための宷伝 was successful.