可変型遺伝子トラップによる挿入突然変異マウス作製とそのカタログ化

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我々は,単なる遺伝子破壊型の変異を作り出すだけではなく,トラップベクターのレポーター遺伝子を任意の遺伝子に置換できるようにするため,バクテリオファージP1由来のCre-loxシステムを応用し,組換え部位であるlox配列に変異を加えたものを用いることでES細胞でNDAを部位特異的に挿入させる方法を開発した。このCre-変異lox組換えシステムでは、lox配列の5'端3'端にそれぞれ変異を加えたlox71とlox66配列、中央部スペーサー領域に変異を加えたlox2272配列を組み合わせて用いる。このシステムをトラップベクターに用いることで、トラップされた遺伝子のプロモーターのコントロール下に別の遺伝子を発現させ、それをマウスで解析することができる。これら変異lox配列を用いた可変型遺伝子トラップベクターpU-17(intron-lox71-splice acceptor-beta geo-loxP-pA-lox2272-pSP73-lox511)を構築し、TT2ES細胞にエレクトロポレーションにより導入、トラップクローンの単離を行なった。現在までに合計767クローンを単離した。これらのクローンについて、挿入パターンをPCRおよびサザンブロットにより解析した結果、約半数のクローンが1コピーの挿入でlox配列を保持していることがわかった。それらのクローンを用い、順次キメラマウスの作製し変異マウスの系統樹立も行なっている。キメラマウスは実体顕微鏡下で行なえるモルラ胚とのアグリゲーション法で作製しており、現在までに34系統の変異マウスラインを樹立した。また、トラップされた遺伝子の解析も5'RACE法により進めている。まだ解析数は10クローン程度であるが、その手法は確立し、確実にRACE産物が得られるようになった。