C4植物由来炭酸固定酵素PEPCのリン酸化による反応制御機構の解明

阐明C4植物源碳酸固定酶PEPC磷酸化的反应控制机制

• 批准号: 12025218
• 负责人: 甲斐 泰
• 金额: $ 0.9万
• 依托单位: Osaka University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (A)
• 财政年份: 2000
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2000 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-12025218/
• 关键词: X線結晶構造解析; 炭酸固定酵素; PEPC; シンクロトロン放射光; 三次元立体構造; 蛋白質の結晶化

C4植物であるトウモロコシの葉からPEPCの大量精製を行い、精製酵素についてMg^<2+>および基質類似物との共結晶化を行った。X線構造解析に適した結晶について、X線構造解析を行った。本結晶は、格子定数が大きいため回折強度が弱く、本研究室にある回転対陰極型X線発生器とX線検出器RAXIS IIcでは精度の高い回折強度データを得ることができない。よって、強力なX線源を用いて回折強度データを収集する必要がある。そこで、平成12年度には高純度サンプルの精製を繰り返し行うことによって、結晶化に必要な大量のサンプルを入手し、結晶化を行った。このために、精製試薬、カラム用充填剤、高純度結晶化試薬の大量に購入した。得られた結晶を用い、播磨SPring-8あるいは筑波高エネルギー物理学研究機構におけるシンクロトロン放射光により、基質類似物・阻害剤非結合型結晶のX線回折強度データの収集を行った。その後、DENZOとSCALEPACKという処理プログラムを用いて回折強度データからFデータを得、構造解析とその精密化を行った。これまでに得られている阻害剤結合型PEPC(大腸菌由来)の立体構造と比較した結果、トウモロコシ由来PEPCの活性部位の構造が大きく変化し、活性型酵素について、多くの新しい構造化学的知見が得られた。

C4 plant leaves are refined in large quantities, enzymes are refined, Mg^<2+> and matrix analogues are crystallized. X-ray structural analysis is suitable for crystallization, X-ray structural analysis is suitable for crystallization. The crystal lattice number is large and the bending strength is weak. In this research room, the bending strength is high and the precision is high. It is necessary to collect the intensity of the X-ray source. In 2012, the company started to refine and crystallize high-purity products. We have purchased a large number of such products as refined reagents, filling agents for production, and high purity crystallization reagents. The X-ray reflection intensity of unbonded crystals obtained from the research institute of physics and the matrix analog was measured by SPring-8. DENZO and SCALEPACK are used to analyze and refine the structure. The results of comparison of the stereo structure of the inhibitor binding PEPC(from Escherichia coli), the structure of the active site of PEPC from Escherichia coli, the structure of the active enzyme, and the structure of the new structure were obtained.

项目成果

H.Matsumura, et al.: "Plausible phosphoenolpyruvate binding site revealed by 2.6 Å structure of Mn2+-bound phosphoenolpyruvate carboxylase from Escherichia coli"FEBS LETT.,. 458,. 93-96 (1999)

H.Matsumura 等人：“来自大肠杆菌的 Mn2+ 结合的磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的 2.6 Å 结构揭示了合理的磷酸烯醇丙酮酸结合位点”FEBS LETT., 93-96 (1999)

T.Shiba, et al.: "Crystallization and preliminary X-ray analysis of a bacterial lysozyme produced by steptomyces globisporus"Acta.Cryst.,. D56,. 1462-1463 (2000)

T.Shiba 等人：“球孢链霉菌产生的细菌溶菌酶的结晶和初步 X 射线分析”Acta.Cryst.,。

G.Kurisu, et al.: "Structure of the zinc-binding site in the crystal structure of a zinc endoprotease from Streptomyces caespitosus at 1 Å resolution"J.of inorganic Biochemistry. 82,. 225-228 (2000)

G.Kurisu 等人：“来自链霉菌锌内切蛋白酶的晶体结构中锌结合位点的结构，分辨率为 1 Å”，无机生物化学杂志 82，2000 年。

K.Umemura, et al.: "The Role of Structural Intersubunit Microheterogeneity in the Regulation of the Activity in Hysteresis of Ribbulose 1,5-Bisphosphate Carboxylase/Oxygenase 1"J.Biochem..,. 128,. 4591-599 (2000)

K.Umemura 等人：“结构亚基间微异质性在调节核酮糖 1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶 1 滞后活性中的作用”J.Biochem...,。

Y.Kai, et al.: "Three-Dimensional Structure of Phosphoenolpyruvate Carboxylase : A Proposed Novel Mechanism fro Allosteric Inhibition"Proc.Natl.Acad.Sci.USA,. 96,. 823-828 (1999)

Y.Kai 等人：“磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的三维结构：一种提议的变构抑制新机制”Proc.Natl.Acad.Sci.USA，。