高等植物葉緑体のチオレドキシンカスケードに調節される酵素群

高等植物叶绿体中硫氧还蛋白级联调控的酶

• 批准号: 12025207
• 负责人: 久堀 徹
• 金额: $ 1.28万
• 依托单位: Tokyo Institute of Technology
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (A)
• 财政年份: 2000
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2000 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-12025207/
• 关键词: チオレドキシン; 葉緑体; ATP合成酵素; ジスルフィド結合

1.酸化還元カスケードを解明する方法として、活性中心の片側のシステインをセリンに置換した変異チオレドキシンを用いて、葉緑体内の一連の標的酵素を捕獲し、これらをアミノ酸のレベルで同定した。その結果、これまで葉緑体チオレドキシンの標的として知られている酵素以外に、新たに4種類の酵素をチオレドキシンと相互作用する候補として同定した。これらのタンパク質あるいはそのホモログについて、アラビドプシスの全RNAからRT-PCR法によって標的遺伝子をクローニングして発現系を構築し、リコンビナント蛋白質を得た。これらの酵素は、分子内にジスルフィド結合を持ち、実際にチオレドキシンと相互作用するか、あるいはその酵素活性が酸化還元によって変化することがわかった。2.葉緑体ATP合成酵素のγサブユニットの調節部位近傍については、調節機能を担う二つのCysの近傍に変異を導入することで、調節機能に直接関与するアミノ酸配列の同定を試みた。そして、この領域がチオレドキシンとの相互作用および阻害サブユニットであるεサブユニットとの相互作用に重要であること、調節領域そのものの構造変化が調節に重要であることを示唆する結果を得た。さらに、γサブユニットの調節領域を含む150アミノ酸残基を安定に複合体が得られる好熱菌複合体の発現系に導入した。この複合体を用いて、1分子の回転観察実験を行い、酵素の制御が1分子レベルでどのように観察されるかを調べた。その結果、酵素を不活性型に陥れる酸化状態では、分子の回転そのものが妨げられるという結果を得た。

1. The acidification and yuan カ ス ケ ー ド を interpret す る method と し の て, activity center piece side の シ ス テ イ ン を セ リ ン に replacement し た - different チ オ レ ド キ シ ン を with い て の の target enzyme in a row, chloroplast を し capture, こ れ ら を ア ミ ノ acid の レ ベ ル で with fixed し た. そ の results, こ れ ま で chloroplast チ オ レ ド キ シ ン の mark と し て know ら れ て い る enzyme に outside, new た に 4 kinds の enzyme を チ オ レ ド キ シ ン と interaction す る alternate と し て with fixed し た. こ れ ら の タ ン パ ク qualitative あ る い は そ の ホ モ ロ グ に つ い て, ア ラ ビ ド プ シ ス の all RNA か ら rt-pcr method に よ っ て mark heritage 伝 son を ク ロ ー ニ ン グ し て 発 now を build し, リ コ ン ビ ナ ン ト protein を た. こ れ ら の enzyme は, intramolecular に ジ ス ル フ ィ ド combining を hold ち, be interstate に チ オ レ ド キ シ ン と interaction す る か, あ る い は そ が acidification の enzyme activity also yuan に よ っ て variations change す る こ と が わ か っ た. 2. The chloroplast ATP synthetase の gamma サ ブ ユ ニ ッ ト の near parts alongside に つ い て は, adjust enginery を bear う つ の Cys の nearly alongside に - different を import す る こ と で, regulating function に masato directly with す る ア ミ ノ acid with column の be を try み た. そ し て, こ の field が チ オ レ ド キ シ ン と の interaction お よ び resistance against サ ブ ユ ニ ッ ト で あ る epsilon サ ブ ユ ニ ッ ト と の interaction に important で あ る こ と, regulating そ の も の の structure - the が important で に あ る こ と を in stopping す た を る results. さ ら に, gamma サ ブ ユ ニ ッ ト を の adjust field contains む 150 ア ミ ノ acid residues を settle に complex が have ら れ る hot bacteria complex の 発 now is に import し た. こ の complex を with い て, 1 molecular の back planning 観 examine be 験 を い, enzyme の suppression が 1 molecular レ ベ ル で ど の よ う に 観 examine さ れ る か を adjustable べ た. そ の results, enzyme を not active に 陥 れ る acidification condition で は, molecular の back planning そ の も の が hinder げ ら れ る と い た を う results.

项目成果

Konno,H.: "Inverse regulation of F1-ATPase activity by a mutation at the regulatory region on the g subunit of chloroplast ATP synthase"Biochemical Journal. 352. 783-788 (2000)

Konno，H.：“叶绿体 ATP 合成酶 g 亚基上的调节区突变对 F1-ATP 酶活性的反向调节”《生化杂志》。

Bald,D.: "ATPase activity of a highly stable a3b3g subcomplex of thermophilic F1 can be regulated by the introduced regulatory region of g subunit of chloroplast F1"Journal of Biological Chemistry. 275. 12757-12762 (2000)

Bald,D.：“嗜热 F1 的高度稳定的 a3b3g 亚复合物的 ATP 酶活性可以通过叶绿体 F1 的 g 亚基的引入调节区进行调节”《生物化学杂志》。