高等植物葉緑体のチオレドキシンカスケードに調節される酵素群

高等植物叶绿体中硫氧还蛋白级联调控的酶

基本信息

批准号：
12025207
负责人：
久堀徹
金额：
$ 1.28万
依托单位：
Tokyo Institute of Technology
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (A)
财政年份：
2000
资助国家：
日本
起止时间：
2000 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-12025207/
关键词：
チオレドキシン葉緑体 ATP合成酵素ジスルフィド結合

项目摘要

1.酸化還元カスケードを解明する方法として、活性中心の片側のシステインをセリンに置換した変異チオレドキシンを用いて、葉緑体内の一連の標的酵素を捕獲し、これらをアミノ酸のレベルで同定した。その結果、これまで葉緑体チオレドキシンの標的として知られている酵素以外に、新たに4種類の酵素をチオレドキシンと相互作用する候補として同定した。これらのタンパク質あるいはそのホモログについて、アラビドプシスの全RNAからRT-PCR法によって標的遺伝子をクローニングして発現系を構築し、リコンビナント蛋白質を得た。これらの酵素は、分子内にジスルフィド結合を持ち、実際にチオレドキシンと相互作用するか、あるいはその酵素活性が酸化還元によって変化することがわかった。2.葉緑体ATP合成酵素のγサブユニットの調節部位近傍については、調節機能を担う二つのCysの近傍に変異を導入することで、調節機能に直接関与するアミノ酸配列の同定を試みた。そして、この領域がチオレドキシンとの相互作用および阻害サブユニットであるεサブユニットとの相互作用に重要であること、調節領域そのものの構造変化が調節に重要であることを示唆する結果を得た。さらに、γサブユニットの調節領域を含む150アミノ酸残基を安定に複合体が得られる好熱菌複合体の発現系に導入した。この複合体を用いて、1分子の回転観察実験を行い、酵素の制御が1分子レベルでどのように観察されるかを調べた。その結果、酵素を不活性型に陥れる酸化状態では、分子の回転そのものが妨げられるという結果を得た。

1。为了阐明氧化还原级联反应，使用突变的硫氧还蛋白在叶绿体中捕获了一系列靶酶，该蛋白用丝氨酸代替了活性中心的一侧，并在氨基酸水平上鉴定出来。结果，除了已知的酶，已被鉴定为与硫氧还蛋白相互作用的候选候选者，但该酶被称为叶绿体硫氧还蛋白的靶标。对于这些蛋白质或其同源物，将靶基因从RT-PCR的拟南芥总RNA中克隆以构建表达系统，并获得了重组蛋白。已经发现这些酶在分子内具有二硫键，并且实际上与硫氧还蛋白相互作用，或者它们的酶活性通过氧化和氧化还原改变了。 2。关于叶绿体ATP合酶的γ亚基附近，我们试图通过在两个发挥调节功能的Cys附近引入突变，从而识别直接参与调节功能的氨基酸序列。获得的结果表明，该区域对于与硫氧还蛋白和ε亚基相互作用很重要，硫氧还蛋白是一个抑制性亚基，而调节区域本身的结构变化对于调节很重要。此外，将含有γ亚基调节区域的150个氨基酸残基引入了嗜热络合物的表达系统中，在这种表达系统中稳定地获得了复合物。使用该复合物，我们进行了单个分子旋转观测实验，以研究如何在单分子水平上观察到酶对照。结果，得到的结果是，酶不活跃的氧化态阻止了分子本身的旋转。