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Rhodococcus属細菌の線状プラスミドを利用したベクター系の開発

使用红球菌线性质粒开发载体系统

基本信息

批准号：
12876018
负责人：
福田雅夫
金额：
$ 1.34万
依托单位：
Nagaoka University of Technology
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Exploratory Research
财政年份：
2000
资助国家：
日本
起止时间：
2000 至 2001
项目状态：
已结题

项目摘要

Rhodococcus sp. RHA1株に存在する線状プラスミドの複製起点についての解析を行い、以下の結果を得た。RHA1株の持つ3種の線状プラスミドのうち、pRHL3の複製起点を含むと思われる6-kb BglII断片を取得し、その塩基配列の決定を行った。その結果、Rhodococcusと近縁なMycobacteriumにおいてプラスミドの複製に関与するタンパク質と優位な相同性を示すopen reading frame(ORF)が見いだされたため、このORFをrep1と命名した。rep1は1020bpからなり、340アミノ酸をコードしている。Rep1が相同性を示したタンパク質は線上プラスミドの複製に関与するものに加えて、環状プラスミドの複製に関与するものもあったことから、両タイプのプラスミドの複製様式に共通性があることが示唆された。rep1遺伝子の上流には他のプラスミドで不和合性に関与することが示唆されているDNA配列が保存されていたが、複製開始時にRepタンパク質が結合すると考えられているアイテロンと呼ばれる配列と相同性を持つ配列は認められなかった。次に、複製に必要な最小領域を同定するためデリーションクローンを作成し、複製に関与する領域をrep1及び上記の保存配列を含む3-kb KpnI断片にまで縮小した。また、取得に成功していないpRHL1及びpRHL3それぞれの片側の末端断片の取得も試みた。pRHL3DNAのPstI消化物に対して、取得済みの1.8-kb pRHL3末端断片をプローブに用いたサザン解析を行ったところ、1.8kbと3.2kbにハイブリダイズした。同様の実験をPstI消化したpRHLl DNAと取得済みの1.2-kb pRHL1末端断片を用いて行ったところ、1.2kb、2.2kb、5kbにハイブリダイズしたため、pRHL1は末端以外の部位に末端断片と相同性を持つ領域があることが示唆された。今後pRHL3の未取得末端をクローニングし単離した複製起点と組み合わせることで、線状ベクターの構築が可能になると考えられる。

Rhodococcus sp. There is a virus in the RHA1 plant. The starting point of replication, the starting point, the starting point, the The RHA1 plant holds three kinds of clones, the starting point of the pRHL3 copy contains the template 6-kb BglII fragment, and the base column determines the row. The results show that the copy is similar to the Mycobacterium, which indicates the similarity between open reading frame (ORF) and ORF. Rep1 is named after the copy. Rep1, 1020bp, acid, acid and acid. The Rep1 is similar to each other in terms of the number of copies, and the number of copies in the environment. The upper level of the rep1 system is responsible for inconsistency and instigation of the DNA configuration to save the file. The copy starts when the Rep file is closed. The configuration is identical and the configuration is the same. It is necessary to use the minimum domain to determine the size of the domain, copy the domain, rep1, and save the file containing 3-kb KpnI fragments. The end of the fragment was successfully tested by pRHL1 and pRHL3. PRHL3DNA the PstI digestion product, get the fragment at the end of the kb pRHL3, and then parse the line. 1.8kb, 3.2kb, 1.8kb. The end fragments of PstI digestion, pRHLl DNA, 1.2kb, 2.2kb, 5kb and other parts outside the end of pRHL1 were used to show that they are identical. In the future, pRHL3 has not been able to obtain a copy of the starting point of the system.