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変異ダイナミン遺伝子導入による赤芽球形態分化過程の検討

引入突变动力基因检测红细胞形态分化过程

基本信息

批准号：
12877002
负责人：
大野伸一
金额：
$ 1.6万
依托单位：
山梨医科大学
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Exploratory Research
财政年份：
2000
资助国家：
日本
起止时间：
2000 至 2001
项目状态：
已结题

项目摘要

本研究の目的は、赤血球の脱核分化過程におけるエンドサイトーシスの関与を、変異ダイナミン遺伝子導入赤芽球系細胞を用いて検討することであった。平成12年度は、ヒト赤芽球系細胞培養法の確立と分化誘導条件について検討した。ヒト腰帯血から得られた細胞を、未成熟造血前駆細胞および幹細胞で特異的に発現するマーカーAC133に対する特異抗体で精製した。AC133陽性細胞を赤芽球系への分化誘導後、光顕用ギムザ染色、トランスフェリンリセプターの免疫組織化学的染色、およびエポン包埋材料の電顕的観察により検討した。その結果、分化誘導3日目より典型的な正染性赤芽球が出現し、以後その割合は増加していった。脱核幼若赤血球は分化誘導5日目より認められるようになった。トランスフェリンリセプター陽性細胞も3日目より出現し、次第に増加した。次に、分化誘導3日目の細胞を用いて、変異ダイナミン遺伝子の導入を試みた。アデノウイルスベクター法では効率が悪いことが判明したため、代わりにトランスフェリンフェクション法を用いた。平成12年度の本研究により、赤芽球系細胞に変異遺伝子の導入が可能となったので、平成13年度は野生型、および変異ダイナミン遺伝子導入した赤芽球細胞を経時的に培養し、以下の検討を行った。(1)4%パラホルムアルデヒドで固定し、サポニン処理後、抗ダイナミン抗体、抗HAtag抗体、抗クラスリン抗体を用い、共焦点レーザー顕微鏡で観察した。(2)細胞膜剥離観察法により、各細胞の上部細胞膜を剥離回収し、レプリカ膜を作製した。一部の試料は抗ダイナミン抗体とコロイド金標識二次抗体を用いた免疫金染色を加えた。(3)赤芽球細胞を急速凍結し、凍結割断を行い、レプリカ膜を作製した。以上の結果より赤芽球分化過程に伴う両側陥凹円盤状赤血球形態形成とトランスフェリン取込みエンドサイトーシスが関連性を有することが明かとなった。

The purpose of this study was to investigate the relationship between the process of erythroid denucleation and differentiation, and the application of different gene transfer into erythroid cells. Establishment of differentiation induction conditions by cell culture method of red bud line in Heisei 12 To purify specific antibodies against AC133, which are specific to the development of hematopoietic progenitor cells, immature hematopoietic progenitor cells and stem cells. After differentiation of AC133-positive cells into red bud line, light staining, immunohistochemical staining, and electroporation of embedded materials were performed. 3 days after the formation of the fruit and differentiation, the typical orthochromatic red buds appeared, and then the cleavage increased. The differentiation of enucleated erythrocytes was induced on the 5th day. The number of positive cells increased from 3 days to 3 days. 3 days after induction of differentiation, the cells were introduced into the medium and the cells were transformed into different cells. It has been determined that the use of the ー method is effective, and the use of theンンmethod is also possible. In this study, we conducted the following research on the possibility of introducing wild-type and heterogenetic-type genes into red bud cells in 2012 and 2013. (1)4 After treatment, anti-HATAG antibody, anti-HATAG antibody and anti-HATAG antibody were used, and confocal microscopy was performed. (2)Cell membrane stripping method: the upper cell membrane of each cell is stripped back, and the membrane is removed. Some of the samples were labeled with secondary antibodies and added with immunogold staining. (3)Red bud cells are rapidly frozen, frozen and cut, and the membrane is made. The above results show that the process of red bud differentiation is accompanied by the formation of discoid red blood cells.