レゾルフィン類/フラビン酵素系を用いる新規生体分析法の開発

使用试卤灵/黄素酶系统开发新的生物分析方法

基本信息

批准号：
12877353
负责人：
大森秀信
金额：
$ 1.15万
依托单位：
Osaka University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Exploratory Research
财政年份：
2000
资助国家：
日本
起止时间：
2000 至 2001
项目状态：
已结题

项目摘要

前年度の知見に基づき、レゾルフィン(1)を生成する還元およびパーハイドロリシス反応について、グルコースおよび過酸化水素(H2_O_2)分析における指示反応としての可能性を検討し、以下の知見を得た。1)アセチルレゾルフィン(3)がH_2O_2との反応(パーハイドロリシス)により1に変換されること、ならびに、本パーハイドロリシスを蛍光指爪反応として用いることによりグルコースオキシダーゼのみを用いてグルコース分析できることを明らかにした。また、本指示反応は、除タンパク操作は必要とはするものの、アスコルビン酸、ビリルビン等の還元性物質の影響を受けることなく血糖値測定に利用できることも見い出した。2)レサズリン(2)から1への還元を指示反応とするグルコースの酵素分析系すなわちグルコースデヒドロゲナーゼ/NAD+/ジアホラーゼ/2系について最適化を行い、本手法が除タンパク処理を必要としない、且つ、アスコルビン酸の影響を受けない血糖値測定法となることを明らかにした。3)3のパーハイドロリシスはグルコース分析における有効な蛍光指示反応として利用できるが、多様な試料中のH_2O_2分析に適用するには、ブランク溶液における単純加水分解による蛍光応答を極力小さくする必要がある。そこで、様々なアシルレゾルフィンを合成するとともに、様々な条件下におけるそれらのパーハイドロリシスに対する感受性ならびに単純加水分解に対する抵抗性を評価した。その結果、アシルレゾルフィン、緩衝液ならびに反応温度として、それぞれピバロイルレゾルフィン、リン酸緩衝液(pH8.0、20mM)ならびに25℃を用いた場合、H_2O_2をより高感度に且つ広い定量濃度範囲で蛍光分析できることを明らかにした。また、リン酸緩衝液(pH7.5、20mM)を用いる、すなわち、より中性に近い条件下における高感度H_2O_2分析はイソブチリルレゾルフィンを用いることにより行えることも見い出した。4)レゾルフィンとは異なる蛍光特性を示すフルオレセイン類や7一ハイドロキシクマリン類のアシル化体が、アシルレゾルフィン類と同様にパーハイドロリシスを受けること、ならびにH_2O_2分析のおける蛍光色原体として利用できることを明らかにした。その結果、分析サンプルに応じて異なる励起および検出波長が利用可能なH_2O_2分析法を確立することができた。

根据上一年的发现，我们研究了减少和水解反应的潜力，这些反应产生了分辨率（1）作为葡萄糖和过氧化氢（H2_O_2）分析中的指示反应，并获得了以下发现。 1）据揭示，乙酰甲酸（3）通过与H_2O_2（polhydrolysyssys）反应转化为1，并且可以仅将葡萄糖氧化酶作为荧光指甲反应使用葡萄糖氧化酶进行。此外，尽管该指标反应需要去除蛋白质，但还发现它可用于血糖水平测量，而不会受到还原物质（例如抗坏血酸和胆红素）的影响。 2）对葡萄糖的酶分析系统进行了优化，即葡萄糖脱氢酶/NAD+/diaphorase/2系统，该系统指导从芦他蛋白（2）降低到1，以揭示此方法不需要蛋白质去除治疗，并且是血糖水平测量方法不受抗蛋白质酸影响的血糖水平测量方法。 3）在葡萄糖分析中，3的钙水解3可以用作有效的荧光指示剂反应，但是要将其应用于各种样品中的H_2O_2分析中，有必要最大程度地减少空白溶液中简单水解引起的荧光响应。因此，合成了各种酰基甲酸酯，并在各种条件下对血液解析的敏感性评估了对简单水解的耐药性。结果，据揭示，当静脉氧酰丙啉吗啡，磷酸盐缓冲液（pH 8.0、20 mm）和25°C时，分别用作酰基甲酸二酚，缓冲液溶液和反应温度，H_2O_2可以用更高的敏感性和更广泛的定量浓度范围进行荧光分析。还发现，在接近中性的条件下，可以使用磷酸盐缓冲液（pH 7.5，20 mm）进行高灵敏度H_2O_2分析。 4）据透露，荧光蛋白的酰化形式和71种羟基丙木蛋白具有与溶解的荧光特性不同的荧光特性，类似于酰基氧酚，并且可以用作H_2O_2分析的荧光染色体。结果，可以建立一种H_2O_2分析方法，其中可以根据分析样本使用不同的激发和检测波长。