レゾルフィン類/フラビン酵素系を用いる新規生体分析法の開発

使用试卤灵/黄素酶系统开发新的生物分析方法

• 批准号: 12877353
• 负责人: 大森 秀信
• 金额: $ 1.15万
• 依托单位: Osaka University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Exploratory Research
• 财政年份: 2000
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2000 至 2001
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-12877353/
• 关键词: グルコース; 過酸化水素; 酸素分析; 指示反応; 蛍光分析; 血糖値測定; パーハイドロリシス; レゾルフィン; グルコースオキシダーゼ; 酵素分析

前年度の知見に基づき、レゾルフィン(1)を生成する還元およびパーハイドロリシス反応について、グルコースおよび過酸化水素(H2_O_2)分析における指示反応としての可能性を検討し、以下の知見を得た。1)アセチルレゾルフィン(3)がH_2O_2との反応(パーハイドロリシス)により1に変換されること、ならびに、本パーハイドロリシスを蛍光指爪反応として用いることによりグルコースオキシダーゼのみを用いてグルコース分析できることを明らかにした。また、本指示反応は、除タンパク操作は必要とはするものの、アスコルビン酸、ビリルビン等の還元性物質の影響を受けることなく血糖値測定に利用できることも見い出した。2)レサズリン(2)から1への還元を指示反応とするグルコースの酵素分析系すなわちグルコースデヒドロゲナーゼ/NAD+/ジアホラーゼ/2系について最適化を行い、本手法が除タンパク処理を必要としない、且つ、アスコルビン酸の影響を受けない血糖値測定法となることを明らかにした。3)3のパーハイドロリシスはグルコース分析における有効な蛍光指示反応として利用できるが、多様な試料中のH_2O_2分析に適用するには、ブランク溶液における単純加水分解による蛍光応答を極力小さくする必要がある。そこで、様々なアシルレゾルフィンを合成するとともに、様々な条件下におけるそれらのパーハイドロリシスに対する感受性ならびに単純加水分解に対する抵抗性を評価した。その結果、アシルレゾルフィン、緩衝液ならびに反応温度として、それぞれピバロイルレゾルフィン、リン酸緩衝液(pH8.0、20mM)ならびに25℃を用いた場合、H_2O_2をより高感度に且つ広い定量濃度範囲で蛍光分析できることを明らかにした。また、リン酸緩衝液(pH7.5、20mM)を用いる、すなわち、より中性に近い条件下における高感度H_2O_2分析はイソブチリルレゾルフィンを用いることにより行えることも見い出した。4)レゾルフィンとは異なる蛍光特性を示すフルオレセイン類や7一ハイドロキシクマリン類のアシル化体が、アシルレゾルフィン類と同様にパーハイドロリシスを受けること、ならびにH_2O_2分析のおける蛍光色原体として利用できることを明らかにした。その結果、分析サンプルに応じて異なる励起および検出波長が利用可能なH_2O_2分析法を確立することができた。

Before the annual の knowledge に base づ き, レ ゾ ル フ ィ ン (1) を generated す る also yuan お よ び パ ー ハ イ ド ロ リ シ ス anti 応 に つ い て, グ ル コ ー ス お よ び acidification passes water element (H2_O_2) analysis に お け る indicating the 応 と し て の possibility を beg し 検, see the following の know を た. 1) ア セ チ ル レ ゾ ル フ ィ ン (3) が H_2O_2 と の anti 応 (パ ー ハ イ ド ロ リ シ ス) に よ り 1 に variations in さ れ る こ と, な ら び に, this パ ー ハ イ ド ロ リ シ ス を 蛍 light fingers against 応 と し て in い る こ と に よ り グ ル コ ー ス オ キ シ ダ ー ゼ の み を with い て グ ル コ ー ス analysis で き る こ と を Ming ら か に し た. ま た, this indicates the 応 は, except タ ン パ ク は necessary operation と は す る も の の, ア ス コ ル ビ ン acid, ビ リ ル ビ ン の is yuan sexual material such as の を by け る こ と な く numerical determination of blood sugar に using で き る こ と も see い out し た. 2) レ サ ズ リ ン (2) か ら 1 へ の yuan を also indicates the 応 と す る グ ル コ ー ス の enzyme analysis system す な わ ち グ ル コ ー ス デ ヒ ド ロ ゲ ナ ー ゼ / NAD + / ジ ア ホ ラ ー ゼ / 2 に つ い て line optimization を い, this technique が except タ ン パ ク 処 Richard を necessary と し な い, and つ, ア ス コ ル ビ ン acid の を by け な い numerical measuring blood sugar The law is となる に とを and ら に た. 3) 3 の パ ー ハ イ ド ロ リ シ ス は グ ル コ ー ス analysis に お け る have sharper な 蛍 light indicates the 応 と し て using で き る が, many others な sample in の H_2O_2 analysis に apply す る に は, ブ ラ ン ク solution に お け る 単 pure hydrolytic decomposition に よ る 蛍 light 応 answer を greatly small さ く す る necessary が あ る. そ こ で, others 々 な ア シ ル レ ゾ ル フ ィ ン を synthetic す る と と も に, others 々 な conditions に お け る そ れ ら の パ ー ハ イ ド ロ リ シ ス に す seaborne る susceptibility な ら び に 単 pure hydrolytic decomposition に す seaborne る resistance を review 価 し た. そ の results, ア シ ル レ ゾ ル フ ィ ン, buffer な ら び に anti 応 temperature と し て, そ れ ぞ れ ピ バ ロ イ ル レ ゾ ル フ ィ ン, リ ン acid buffer (pH8.0, 20 mm) な ら び に 25 ℃ を with い た occasions, H_2O_2 を よ り に Gao Gan degrees and つ hiroo い quantitative concentration van 囲 で 蛍 light analysis で き る こ と を Ming ら か に し た. ま た, リ ン acid buffer (pH7.5, 20 mm) を い る, す な わ ち, よ り under the condition of neutral に nearly い に お け る Gao Gan degrees H_2O_2 analysis は イ ソ ブ チ リ ル レ ゾ ル フ ィ ン を with い る こ と に よ り line え る こ と も see い out し た. 4) レ ゾ ル フ ィ ン と は different な る 蛍 light feature を shown す フ ル オ レ セ イ ン class や 7 ハ イ ド ロ キ シ ク マ リ ン class の ア シ ル body が, ア シ ル レ ゾ ル フ ィ ン class と with others に パ ー ハ イ ド ロ リ シ ス を by け る こ と, な ら び に H_2O_2 analysis の お け る 蛍 light color of chlamydial と し て using で き る こ と を Ming ら か に し た. そ の results, analysis サ ン プ ル に 応 じ て different な る wound up お よ び 検 wavelength が may use な H_2O_2 analysis を establish す る こ と が で き た.

项目成果

前田初男: "Hydrogen Peroxide-Induced Deacetylation of Acetyl Resorufin as a Novel Indicator Reaction for fluorometric Detection of Glucose Using only Glucose Oxidase"Chemical and Pharmaceutical Bulletin. 49(in press). (2001)

Hatsuo Maeda：“过氧化氢诱导的乙酰试卤灵脱乙酰化作为仅使用葡萄糖氧化酶进行葡萄糖荧光检测的新型指示剂反应”《化学和制药通报》49（出版中）。

前田初男: "Resazurin as an electron acceptor in glucose oxidase-catalyzed oxidation of glucose"Chemical and Pharmaceutical Bulletin. 49. 622-625 (2001)

Hatsuo Maeda：“刃天青作为葡萄糖氧化酶催化的葡萄糖氧化中的电子受体”《化学与药物通报》49. 622-625 (2001)。

松浦伸哉: "Blood glucose determination with the reduction of resazurin as a fluorometric indicator reaction"Bunseki Kagaku. 51. 111-115 (2002)

Shinya Matsuura：“用刃天青还原作为荧光指示剂反应测定血糖”Bunseki Kagaku。 51. 111-115 (2002)。

前田初男: "Hydrogen peroxide-induced deacetylation of acetyl resorufin as a novel indicator reaction for fluorometric detection of glucose using only glucose oxidase"Chemical and Pharmaceutical Bulletin. 49. 294-298 (2001)

Hatsuo Maeda：“过氧化氢诱导的乙酰试卤灵脱乙酰化作为仅使用葡萄糖氧化酶荧光检测葡萄糖的新反应”《化学和制药公报》49. 294-298 (2001)。

前田初男: "Resorufin as an Electron Acceptor in Glucose Oxidase-Catalyzed Oxidation of Glucose"Chemical and Pharmaceutical Bulletin. 48. 897-902 (2000)

Hatsuo Maeda：“试卤灵在葡萄糖氧化酶催化的葡萄糖氧化中作为电子受体”《化学与制药通报》48. 897-902 (2000)。