アミノ酸配列決定に用いる新規化学発光ラベル化試薬の開発

新型氨基酸测序化学发光标记试剂的开发

• 批准号: 12877355
• 负责人: 甲斐 雅亮
• 金额: $ 0.32万
• 依托单位: Nagasaki University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Exploratory Research
• 财政年份: 2000
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2000 至 2001
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-12877355/
• 关键词: アミノ酸配列; エドマン分解法; 化学発光検出; ペプチドシーケンス; 高感度検出; 超微量分析; CIPIC; エドマン試薬

生体内には,極微量で生理活性を示すペプチドが多種存在しており,今後も未知なる生理活性ペプチドが発見されるものと考える。よって,常法のエドマン法より少なくとも100倍ほど高感度なアミノ酸配列の決定法が開発されれば,生体からのペプチドやタンパク質の精製量が従来の100分の1の量でよく,プロテオーム解析の研究は飛躍的に進展できる。本研究では、研究代表者らが開発しているアミノ酸の高反応性蛍光ラベル化試薬であるCIPICの分光学的特性を調べることによって、それを新規の化学発光性試薬として活用し、タンパク質のアミノ酸配列決定に用いられている従来のエドマン試薬よりも、極めて高感度な手法を開発することを目的としている。本年度の研究において、Ala-Leu-Glyトリペプチドを用いて、ピリジン存在下、含水溶液中でCIPIC試薬と完全にカップリングさせる条件とペプチドのアミノ末端からアミノ酸を逐次分解させる反応条件を設定できた。すなわち、ペプチドの水溶液をCIPICのピリジン含有アセトニトリル溶液と混合し、80℃で15分間加熱することによって、ペプチドのN末端アミノ基とCIPICをカップリングした。その後、過剰のCIPIC及びその分解物を酢酸ニチルで抽出し、水層に残るペプチドのカップリング体を塩酸酸性中で80℃で5分間加熱することによって、N末端のアミノ酸が効率良く逐次分解できることが分かった。この逐次分解したアミノ酸のCIPICヒダントイン体は、ホウ酸緩衝液(pH9.5)中過酸化水素の存在下で、酸化的に分解し化学発光するので、従来の試薬より約100倍ほど高感度に検出できた。この価値ある研究成果によって、今後、超微量ペプチドやタンパク質のアミノ酸配列の自動シーケンサーの開発も可能であると考える。

In vivo, there are many kinds of physiological activities in the body, and the physiological activities are unknown in the future. The determination method of acid alignment was developed by the method of common method, and the amount of purification of biological material was 1/100 of the original amount. The research progress of analysis of biological material was greatly improved. This study aims to develop a new method for determining the use of highly reactive photoactive agents in acid alignment by developing highly reactive photoactive agents for CIPIC chemical testing. In this year's study, the conditions for the complete decomposition of CIPIC in aqueous solution in the presence of Ala-Leu-Gly catalyst were set. The aqueous solution of CIPIC is mixed and heated at 80℃ for 15 minutes. The N-terminal group of CIPIC is mixed and heated. The decomposition products of CIPIC and N-terminal are extracted from the aqueous layer and heated in the acidic medium at 80℃ for 5 minutes. In the presence of peracidified water in an acid buffer (pH 9.5), the acid decomposes and chemically emits light. The sensitivity is about 100 times higher. The results of this research are expected to be published in the future, and the possibility of developing ultra-micro-scale acid coordination and automatic acid coordination will be examined.

项目成果

N.Kuroda, et al: "Chemiluminescence detection in LC (in Chemiluminescence in analytical chemistry)"Marcel Dekker, Inc.,(発表予定). p33 (2001)

N.Kuroda 等人：“LC 中的化学发光检测（分析化学中的化学发光）”Marcel Dekker, Inc.，（即将出版）第 33 页（2001 年）。

J.Lu, et al.: "A Chemiluminescence reaction between hydrogen peroxide and accetonitrile and its applications"Analytical Chemistry. 73. 5979-5983 (2001)

J.Lu等人：“过氧化氢与乙腈之间的化学发光反应及其应用”分析化学。

N.Kuroda, et al.: "Chemiluminescence detectlonin liquid chromatography (in Chemiluminescence in Analytical Chemistry)"Marcel Dekker, Inc.. 33 (2001)

N.Kuroda 等：“化学发光检测液相色谱（分析化学中的化学发光）”Marcel Dekker, Inc. 33 (2001)

S.-H.Kim, et al: "Effects of hydrastine derivatives on dopamine biosynthesis in pc12 cells"Planta Med.,. 67(発表予定). (2001)

S.-H.Kim 等人：“Hydrastine 衍生物对 pc12 细胞中多巴胺生物合成的影响”Planta Med.，67（待出版）。