核酸検出に用いる新規水溶性化学発光高分子プローブの創製

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本研究課題の目的は、DNA検出用の新たな超高感度プローブを創製することである。研究代表者らは、昨年度の研究において、多糖分子に、水溶性を損なうことなく低分子量の化学発光物質であるルミノールまたはイソルミノールを多数結合させる強発光性高分子の合成手法を確立した。本年度は、平均分子量200万のデキストラン分子[(Glc)_<12300>]に、まずルミノール(Lu)、又は、イソルミノール(Ilu)を結合させた(Ilu)_<3700>-(Glc)_<1230>及び(Lu)_<1900>-(Glc)_<12300>を合成し、分光学的測定値を比較した。その結果、両高分子の蛍光強度は遊離のルミノールやイソルミノールの約60-80倍の強度しか得られなかったが、化学発光強度は、(Ilu)_<3700>-(Glc)_<12300>では遊離のイソルミノールの7700倍を示し、(Lu)_<1900>-(Glc)_<12300>では遊離のルミノールの210倍を示した。このことから、デキストランに導入する低分子量化学発光物質としてはイソルミノールの方が優れていることが示唆された。また、溶液中のこれらの発光性高分子の化学発光の検出感度は、蛍光のそれよりも約100倍高く、約2×10^<-16>molの検出限界(S/N=2)を示した。次に、イソルミノールとビオチン(Bio)の結合数をコントロールした3種の化学発光性デキストラン分子、(Ilu)_<850>-(Bio)_<330>-(Glc)_<12300>、(Ilu)_<600>-(Bio)_<660>-(Glc)_<12300>及び(Ilu)_<400>-(Bio)_<1100>-(Glc)_<12300>を合成した。DNAのハイブリダイゼーションアッセイ用のナイロン膜にスポットした時、等モルのそれらの化学発光強度は、分子中のイソルミノールの結合比にほぼ相応していた。さらに、これらの化学発光性デキストランは、分子中のビオチンを介して膜上のアビジンと結合して、特異的に化学発光スポットを与えた。以上のことから、本研究で開発した化学発光性デキストラン分子は、アビジンに特異的に結合し、超高感度な発光プローブとしての適用が期待できる。