ウイルス性がん遺伝子産物による転写コアクチベーターの機能制御

病毒癌基因产物对转录共激活因子的功能调节

• 批准号: 01J03339
• 负责人: 改田 厚
• 金额: $ 1.28万
• 依托单位: Kyoto University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2001
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2001 至 2002
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-01J03339/
• 关键词: ウイルス性がん遺伝子; 転写コアクチベーター; CBP; p300; 核酸生合成

本研究においてCBP,p300のKIX領域のGST融合タンパク質を大腸菌にて作製し、代謝標識したJurkat細胞抽出液を用いてGST-pull down assayを行った。その結果、p300のKIX領域特異的に結合する細胞性因子を見い出した。二次元電気泳動による分離後、質量解析により同定を試みた結果、標的タンパク質は、核酸生合成に関与するphosphoribosyl pyrophosphate synthetase 1 (PRS1)であることが判明した。CBP,p300とPRS1との関係について現在までに以下の新たな知見を得た。1.p300分子内のPRS1結合領域の決定in vitroで合成した[^<35>S]-methionine代謝標識のPRS1を用いてGST-pull down assayを行った結果、p300のPRS1結合領域は567番目のアミノ酸から652番目のアミノ酸の間に存在することが示唆された。2.mammalian two hybrid systemを用いた全長CBP、p300とPRS1の結合検討mammalian two hybrid systemは、Gal4 DNA結合領域に融合させたXタンパク質とVP16に融合させたYタンパク質において培養細胞内で結合するとレポータープラスミドが反応し、ルシフェラーゼ活性の上昇が検出される系である。培養細胞株のMCF7細胞にGal4DNA結合領域に融合したPRS1、VP16に融合させたCBPまたはp300を遺伝子導入後、ルシフェラーゼアッセイを行った。その結果、VP16-p300のみルシフェラーゼ活性の上昇が検出された。さらにp300のPRS1結合領域を欠失させた変異体p300では、ルシフェラーゼ活性の上昇が検出されなかったことからPRS1はp300特異的に結合することが示唆された。3.PRS1分子内のp300結合領域の決定およびp300(KIX)に結合しない点変異体PRS1の作製PRS1はp300(KIX)領域に結合するがPRS1とアミノ酸レベルにおいて94%のホモロジーを有するPRS2は結合しないことが判明した。PRS1とPRS2のキメラタンパク質発現プラスミドを作製し、in vitroで合成した[^<35>S]-methionine代謝標識のキメラタンパク質を用いてGST-pull down assayを行った結果、PRS1の170番目のアミノ酸から190番目のアミノ酸がp300(KIX)との結合に重要であることが判明した。PRS1の点変異体を用いた解析からPRS1の188番目のアミノ酸がp300(KIX)との会合に重要であり、PRS1の点変異体PRS1(D188E)では、その結合能が顕著に低下した。現在、PRS1,PRS2,PRS1(D188E)を用いて、CBP,p300それぞれのヒストンアセチル化活性、転写コアクチベーター能に及ぼす影響について検討中である。

In this study, GST-pull-down assay was performed for CBP,p300 and KIX domain GST-fusion protein in Escherichia coli and Jurkat cell extracts. The results showed that p300 and KIX domain specific binding of cytokines were detected. After separation, mass analysis and identification, the results of experiments, the quality of samples and nucleic acid synthesis were identified. CBP,p300 and PRS1 are related to each other. 1. Determination of PRS1 binding domain in p300 molecule in vitro synthesis of [^<35>S]-methionine metabolic marker PRS1 using GST-pull down assay results, p300 PRS1 binding domain in 567 amino acids, 652 amino acids and the existence of intermediate amino acids. 2. The fusion between full-length CBP, p300 and PRS1 in mammalian two hybrid system and Gal4 DNA binding domain was studied. The fusion between CBP, p300 and PRS1 in mammalian two hybrid system was studied. Cultured MCF7 cells were fused to Gal 4 DNA binding domain, and VP16 was fused to CBP p300 gene. As a result, the activity of VP16-p300 increased rapidly. P300 and PRS1 binding domain are missing, and the activity of the mutant p300 is increasing. 3. The determination of the p300 binding domain within the PRS1 molecule and the binding of the p300(KIX) domain are the key points in the manufacture of the variant PRS1. It is clear that PRS1 binds to the p300(KIX) domain, so that 94% of the molecules in the PRS1 and Avanade acid range are bound to PRS2. PRS1 and PRS2 were identified by the <35>GST-pull down assay, which was performed on PRS1 and PRS2 in vitro. PRS1 point variant application analysis PRS1 point variant application analysis Now, PRS1, PRS2, PRS1 (D188E), CBP,p300 are included in this study.

项目成果

Yasuo Ariumi: "Distinct nuclear body components, PML and SMRT, regulate the trans-acting function of HTLV-1 Tax oncoprotein"ONCOGENE. 22. 1611-1619 (2003)

Yasuo Ariumi：“不同的核体成分，PML 和 SMRT，调节 HTLV-1 Tax 癌蛋白的反式作用功能”ONCOGENE。