シアノバクテリア信号伝達タンパク質の分子アーキテクチャー

蓝藻信号蛋白的分子结构

基本信息

批准号：
12019211
负责人：
大森正之
金额：
$ 1.28万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (A)
财政年份：
2001
资助国家：
日本
起止时间：
2001 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

シアノバクテリアにおけるゲノム解析は、すでに3種類のラン藻において塩基配列がほぼ決定された。全ゲノム解析の次の段階として、全タンパク質の構造解析と機能解析が期待される。構造が未知のタンパク質については、既知のタンパク質のX線解析データを基にアミノ酸配列の相同性からコンピューターによる構造予測が可能である。我々は、CyaGの触媒部位をGSTとの融合タンパク質として大腸菌で大量発現させ、アフィニテイークロマトグラフィー、ゲル濾過などの方法によってタンパク質の精製した。次に触媒部位の3つのアミノ酸を置換した変異体を作り、ATP,GTPを基質として酵素活性を測定したところ、変異体はアデニル酸シクラーゼではなくグアニル酸シクラーゼを合成していることが明らかとなった。アミノ酸を置換した触媒部位と置換する前の触媒部位について、ホモロジーモデリングにより、基質との結合の構造予測を行ったところ、アミノ酸置換によって基質特異性が変化したことが確認された。一方、cAMP分解酵素であるcAMPホスホジエステラーゼに関しては、活性の存在は報告されているものの遺伝子の構造や活性調節機構についても全く不明であった。我々は、大腸菌のcAMPホスホジエステラーゼ遺伝子cpdAと相同性を持つorfを見つけた。大腸菌においてこのorfを(His)x6タグ融合タンパク質として発現させ、精製を行った。この精製タンパク質はcAMP分解活性を示した。そこで大腸菌のホスホジエステラーゼをモデルとしてこの酵素の構造を予測した

蓝细菌中的基因组分析已经导致了几乎所有三种类型的蓝细菌的核苷酸序列。预计整个基因组分析的下一步将是对所有蛋白质的结构和功能分析。对于具有未知结构的蛋白质，可以基于氨基酸序列的同源性基于已知蛋白质的X射线分析数据进行基于计算机的结构预测。我们将Cyag的催化位点表示为融合蛋白，其中GST在大肠杆菌中，并通过诸如亲和色谱和凝胶过滤等方法纯化了蛋白质。接下来，创建了一个突变体，在催化位点更换了三个氨基酸，并使用ATP和GTP作为底物测量了酶活性，并且发现突变剂合成鸟苷酸环化酶而不是腺苷酸化酶。当通过催化位点的同源模型预测氨基酸在被替换的催化位点取代之前，通过同源性建模预测了与底物的结构，则证实由于氨基酸取代而改变了底物特异性。另一方面，据报道，营地磷酸二酯酶是一种降解酶的磷酸二酯酶具有活性，但是活性调节的基因结构和机理并不完全未知。我们发现与大肠杆菌中的CAMP磷酸二酯酶基因CPDA具有同源性ORF。该ORF表示为（His）X6在大肠杆菌中标记融合蛋白并纯化。这种纯化的蛋白质表现出营地降解活性。因此，我们使用大肠杆菌磷酸二酯酶作为模型预测了该酶的结构。