RNAiを用いたショウジョウバエ変異体ライブラリーの構築

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RNAiは二本鎖RNAを用い、標的遺伝子の発現(mRNA)をノックアウト(分解)する新技術である。ゲノム計画により明らかにされた遺伝子の系統的な機能解析にきわめて適している。本研究の目的は1)逆方向反復配列からなるRNAを発現させるDNA(IR-cDNA)を系統的に作成し、それをP因子導入法でショウジョウバエ個体に導入した変異体ライブラリーを系統的かつ網羅的に作成する技術を開発すること、及び2)1000系統からなる初期的な変異体ライブラリを実際に作成し、発生分化の機構解明に利用することにある。平成13年度は、以下の成果を得た。1)PCRプライマーの制限酵素サイトを2重にし、クローニングサイトを改良したベクターを改良した。また、至適なプライマー配列をコンピューターにより計算し、11000遺伝子について得ている。2)逆方向反復配列の間にイントロン配列を挿入することにより、RNAi効果を増強した。現在までに約1800遺伝子のIR-cDNAを作成し、またmicroinjectionによるハエの形質転換は700遺伝子について終了た。3)emc IR-cDNAと欠失染色体を用いた遺伝学的な解析から、多数のエンハンサー・サプレッサーの存在が明らかになり、これまで第3染色体上にそれぞれ2カ所の領域を特定、そのうちの1染色体領域に存在する65の遺伝子について、培養細胞でのルシフェラーゼ・アッセイを利用し、RNAiにおよぼす影響を検討した。3種の遺伝子がRNAiに必要である可能性があることが分かり、現在詳細な解析をおこなっている。4)dsR NAを2lbpに切断する酵素候補として、Dicer 1とDicer 2が知られていたが、Dicer 2の遺伝子は、N末のごく一部に対する配列しか分かっていなかった。完全なDicer 2のcDNAを単離し、配列を決めた。dsR NA切断の分子物差し機構を解明するためにDicerのds RNA結合ドメインとRnase IIIドメインを大量調製し結晶化した。構造解析の専門家と共同実験を始めている。