タンパクアレイを指向した新規タンパク固定化センサを用いるタンパク機能評価システム

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本研究では、ゲノム機能解析で重要な種々のタンパクの機能評価のための実用的タンパク固定化チップを実現するためのタンパク固定化センサーの開発と機能評価システムの基礎検討を目的とした。まず、タンパクを金電極上に固定化するために、末端ジスルフィド型NTA誘導体を開発し、これを金表面に修飾してニッケル錯体とした。これに、エストロゲンレセプターのリガンド結合ドメインにヒスチジンタグを付加したものを大腸菌で発現して修飾を試みたところ、レドックスマーカーとして、フェロシアン化物イオンを用いたサイクリックボルタンメトリーによる検討から、エストロゲンの濃度依存的応答が見られ、タンパクの活性を維持したまま良好に固定化できることが分かった。このセンサーは、エストロゲンのほかにも各種アゴニストと結合定数に依存して応答を示した。これに対し、アンタゴニストでは異なる応答を示し、両者を見分けられる可能性が示された。また、ヒスチジンタグを有するタンパクを検出できる蛍光分子プローブとして、NTA型フルオレセイン誘導体も開発した。ナイロンメンブレンを用いた検討で、10ngレベルのタンパクが検出可能であることが、ヒスチジンタグを付加して発現させた転写因子であるPOUドメインを用いて示された。また、これとは別に、電極活性なフェロセンを有するNTA誘導体型プローブも合成に成功した。以上の成果により、タンパク間相互作用やタンパク-リガンド相互作用を、電気化学や蛍光により簡便に検出できるシステムの基本的概念が確立できた。