Development of ultrasensitive detection method for call membrane antigen and its application to cancer companion diagnosis

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本研究では細胞膜抗原の高感度検出法の開発と、それを用いたがんコンパニオン診断の開発を目的としている。2022年度は、昨年度、探索したヒト直交性酵素に関し、診断法への適用における性能を評価した。見出した8種の酵素に関して、タイプの異なるヒト細胞株(JY25, HeLa, HepG2, MCF-7)を用いて、生細胞、細胞破砕液（pH 7.4あるいは4.5）で内在活性を評価した。臨床診断に汎用される酵素も同時に評価したところ、これらの汎用酵素では、用いた細胞全てで内在活性が確認されたが、見出した8種の酵素では、内在活性が認められず、ヒト直交性酵素であることが確認できた。酵素活性の評価から、何れも診断に適用可能な活性を有していることが分かった。α-ラムノシダーゼについては由来の異なる2種の酵素を取得した。活性はいずれも診断への適用の条件を満足していたが、一方は、細胞に対する非特異吸着が確認されたため、非特異吸着が見られなかったものを用いることとした。とくにすぐれた性能を有すると期待できるα-アラビノフラノシダーゼ、α-ラムノシダーゼ、β-キシロシダーゼについて基質プローブを合成して、Cell ELISAにて細胞膜抗原の検出を試みたところ、Her3、EpCAMの検出を対象とする評価で、いずれも優れた検出能を示した。しかも、従来の診断用酵素に比べ高いS/N比を示した。次に、上記の3種の新規酵素に対する蛍光基質型分子プローブを開発し、合成に成功した。いずれも、3種の酵素間での交差反応性は全くないことも評価した。EGFR、Her3、EpCAMの同時検出を試みたところ、HepG2を用いて同時検出にも成功した。現在、この3種の酵素に対して多色型、かつ反応後に細胞に集積できるCLAMP型基質の合成を実施中である。