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Development of ultrasensitive detection method for call membrane antigen and its application to cancer companion diagnosis

Call膜抗原超灵敏检测方法的研制及其在癌症伴随诊断中的应用

基本信息

批准号：
21H04686
负责人：
片山佳樹
金额：
$ 25.96万
依托单位：
Kyushu University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (A)
财政年份：
2021
资助国家：
日本
起止时间：
2021-04-05 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

本研究では細胞膜抗原の高感度検出法の開発と、それを用いたがんコンパニオン診断の開発を目的としている。2022年度は、昨年度、探索したヒト直交性酵素に関し、診断法への適用における性能を評価した。見出した8種の酵素に関して、タイプの異なるヒト細胞株(JY25, HeLa, HepG2, MCF-7)を用いて、生細胞、細胞破砕液（pH 7.4あるいは4.5）で内在活性を評価した。臨床診断に汎用される酵素も同時に評価したところ、これらの汎用酵素では、用いた細胞全てで内在活性が確認されたが、見出した8種の酵素では、内在活性が認められず、ヒト直交性酵素であることが確認できた。酵素活性の評価から、何れも診断に適用可能な活性を有していることが分かった。α-ラムノシダーゼについては由来の異なる2種の酵素を取得した。活性はいずれも診断への適用の条件を満足していたが、一方は、細胞に対する非特異吸着が確認されたため、非特異吸着が見られなかったものを用いることとした。とくにすぐれた性能を有すると期待できるα-アラビノフラノシダーゼ、α-ラムノシダーゼ、β-キシロシダーゼについて基質プローブを合成して、Cell ELISAにて細胞膜抗原の検出を試みたところ、Her3、EpCAMの検出を対象とする評価で、いずれも優れた検出能を示した。しかも、従来の診断用酵素に比べ高いS/N比を示した。次に、上記の3種の新規酵素に対する蛍光基質型分子プローブを開発し、合成に成功した。いずれも、3種の酵素間での交差反応性は全くないことも評価した。EGFR、Her3、EpCAMの同時検出を試みたところ、HepG2を用いて同時検出にも成功した。現在、この3種の酵素に対して多色型、かつ反応後に細胞に集積できるCLAMP型基質の合成を実施中である。

The purpose of this study is to develop a highly sensitive detection method for cell membrane antigens. In 2022, we explored the application of direct enzyme and diagnostic methods and evaluated their performance. The intrinsic activity of 8 enzymes was evaluated in cell culture and cell lysis solutions (pH 7.4 - 4.5) using JY25, HeLa, HepG2, MCF-7). Clinical diagnosis of the enzyme used in the general evaluation of the enzyme, the use of the enzyme in the whole cell to confirm the intrinsic activity, see the enzyme, the intrinsic activity of the enzyme identified. The enzyme activity is evaluated, and the diagnosis is applicable. 2 enzymes are obtained from different origins. The activity of the enzyme is determined by the presence of the enzyme in the cell. In addition, the expression of α-glucagon, β-glucagon and β-glucagon in Cell membrane antigen was evaluated. High S/N ratio of diagnostic enzymes The three new enzymes described above have been successfully developed and synthesized. There are three kinds of enzymes in the middle, and there are three kinds of enzymes in the middle. EGFR, Her3, EpCAM and HepG2 were successfully detected simultaneously. At present, the synthesis of CLAMP-type substrates is under way in cells where these three enzymes are concentrated in polychromatic and reverse reactions.