大腸菌を用いた真核生物のイオン輸送系膜蛋白質の解析

使用大肠杆菌分析真核离子转运膜蛋白

• 批准号: 13206032
• 负责人: 魚住 信之
• 金额: $ 2.69万
• 依托单位: Nagoya University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (C)
• 财政年份: 2001
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2001 至 2002
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-13206032/
• 关键词: トポロジー; 膜貫通; イオン透過孔; 大腸菌発現系; 糖鎖; AtKUP1; AtHKT1; Ktr

(1)AtKUP1(KUP系)のトポロジーを大腸菌発現系を用いて決定したところ、意外にも4回膜貫通構造であった。(疎水領域は13カ所存在する)。次にこの結果の真偽を検証し、大腸菌の発現系の有効性を評価するために、検証の必要な箇所をイヌの膜小胞や動物細胞HEK293を宿主とする発現系を用いた糖鎖修飾実験を行い大腸菌の結果と比較した。その結果、大腸菌発現系と異なる結果が得られた貫通領域が見つかった。(2)HKT系(AtHKT1)のトポロジーから推定されるイオン透過孔に存在する特徴的なアミノ酸を置換し、Na^+とK^+の選択部位を決定したところ、AtHKT1のSer68とMet69がGly-Leuに変換されることにより、K^+透過選択性に変わることが明らかとなった。Na^+とK^+の選択部位の決定は本輸送系の本質的でアイデアルばかりではなく、あらゆるK^+の輸送系に必須のイオン選択孔の構造の一般化に重要な知見となる。(3)Synechocystis sp. PCC6803のKtr系を大腸菌に発現させて解析したところ、KtrABCの3つのサブユニットでK^+の輸送を行うことを明らかにした。またNa^+によって輸送活性が大きくなることを示した。(4)K^+チャネル(KAT1)の親水性膜貫通領域はpost-translationalに小胞体膜に挿入されることを示し、以前の大腸菌で得られた結果と一致した。親水性膜貫通領域は隣の親水性膜貫通領域と相互作用をして生体膜に移行することがあることを見出した。(5)植物にも存在する細菌Na^+/H^+antiporterの膜貫通領域に存在するAspはH^+の透過には関与するがNa^+の透過には関与しないことを示した。

(1) AtKUP1 (kups) の ト ポ ロ ジ ー を coliform 発 practice while department を い て decided し た と こ ろ, accident に も 4 back transmembrane structure で あ っ た. (疎 water domain 疎 13カ exists する). Time に こ の results の authenticity を 検 し, coliform の 発 now is の have sharper sex を review 価 す る た め に, 検 の を な a needed イ ヌ の membrane vesicular や animal cell HEK293 を host と す る 発 practice while department を い た sugar lock decorate be 験 を line い coliform の results と し た. The そ results and the coliform bacteria are と different なる results が the られた through field が can be seen in った が った った. (2) HKT (AtHKT1) の ト ポ ロ ジ ー か ら presumption さ れ る イ オ ン through holes exist に す る of 徴 な ア ミ ノ acid を replacement し, Na + と K ^ ^ + の sentaku parts を decided し た と こ ろ, AtHKT1 の Ser68 と Met69 が Gly - Leu に variations in さ れ る こ と に よ り, K ^ + through sentaku sex Youdaoplaceholder0 change わる とが とが Ming ら となった となった. Na ^ ^ + + と K の sentaku parts の decided は the nature of the conveyor is の で ア イ デ ア ル ば か り で は な く, あ ら ゆ る K ^ + の に transport department must の イ オ ン の sentaku hole structure の important な knowledge generalization に と な る. (3) Synechocystis sp. PCC6803 の Ktr is を coliform に 発 now さ せ て parsing し た と こ ろ, KtrABC の 3 つ の サ ブ ユ ニ ッ ト で K ^ + の conveying line を う こ と を Ming ら か に し た. The transport activity of またNa^+によって is が large また くなる <s:1> とを とを とを shows た. ^ (4) K + チ ャ ネ ル (KAT1) の hydrophilic transmembrane domain は post - translational に small cell body membrane に scions into さ れ る こ と を し, before の coliform で must ら れ た と consistent し た. Hydrophilic transmembrane domain は 隣 の hydrophilic transmembrane domain と interaction を し て raw body membrane に transitional す る こ と が あ る こ と を shows し た. (5) plant に も exist す る bacteria Na + / H + antiporter ^ ^ の transmembrane domain に there す る Asp は H ^ + の through に は masato and す る が Na ^ + の through に は masato and し な い こ と を shown し た.

项目成果

魚住 信之: "化学と生物(植物のK^+チャネル・K^+トランスポーターはどこまでわかったか)"5 (2001)

鱼住伸行：“化学与生物学（我们对植物中的 K^+ 通道和 K^+ 转运蛋白了解多少）”5 (2001)

Sato et al.: "Integration of Shaker-type K^+ channel, KAT1 into the endoplasmic reticulum membrane : Synergistic insertion of voltage sensing segments, S3-S4 and independent insertion of pore-forming segments, S5-P-S6"Proc.Natl.Acad.Sci.USA. 99. 60-65 (20

Sato 等人：“Shaker 型 K^ 通道、KAT1 整合到内质网膜中：电压传感片段 S3-S4 的协同插入和成孔片段 S5-P-S6 的独立插入”Proc.Natl

Kato et al.: "Evidence in support of four transmembrane-pore-transmembrane topology model for the Arabidopsis thaliana Na^+/K^+ translocating AtHKT1 protein, a member of the superfamily of K^+ transporters"Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 98. 6488-6493 (2001)

Kato 等人：“支持拟南芥 Na^ /K^ 易位 AtHKT1 蛋白（K^ 转运蛋白超家族的成员）的四种跨膜-孔-跨膜拓扑模型的证据”Proc。

Nakamura et al.: "Residue aspartate-147 from the third transmembrane region of Na^+/H^+ antiporter NhaB of Vibrio aliginolyticus plays a role in its activity"J.Bacteriol. 183. 5762-5757 (2001)

Nakamura 等人：“溶藻弧菌 Na^/H^ 逆向转运蛋白 NhaB 第三跨膜区的残基天冬氨酸 147 在其活性中发挥作用”J.Bacteriol。

Uozumi N.: "Escherichia coli as an expression system for K^+ transport systems from plants"Am.J.Physiol.. 281. C733-C739 (2001)

Uozumi N.：“大肠杆菌作为来自植物的K^转运系统的表达系统”Am.J.Physiol..281.C733-C739(2001)