权益分类	功能权益	普通用户	{{item.name}}会员
{{category.name}}	{{benefitItem.name}}

ビジュアルスクリーニング法を用いた耳下腺細胞の新規シグナル分子の検索と機能解析

目视筛选法寻找腮腺细胞中新型信号分子并进行功能分析

基本信息

批准号：
15791066
负责人：
森田貴雄
金额：
$ 2.18万
依托单位：
Health Sciences University of Hokkaido
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
财政年份：
2003
资助国家：
日本
起止时间：
2003 至 2005
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-15791066/
关键词：
GFP 耳下腺腺房細胞可視化細胞内局在アミラーゼ SMG IP_3受容体 Ca^<2+>流入

项目摘要

耳下腺腺房細胞における水・電解質分泌やタンパク質の開口分泌はCa^<2+>、PKC、PKAなどで調節されるが、その下流の情報伝達機構や転写調節機構は明らかにされていない。本研究は、耳下腺腺房細胞の情報伝達や転写制御に関与する分子群を明らかにすることを目的とする。ラット耳下腺由来cDNAライブラリーに含まれる遺伝子をGFP融合タンパク質として発現させ、それらの局在を指標にして未知のタンパク質を検索するVisual Screeningの開発を試みた。いくつかのスクリーニング法を試行し、その効率を比較検討したところ、定常発現法より一過性発現法によるスクリーニングが効率的であると考えられた。特異的局在を示し、frameが合う形でGFPと融合タンパク質をつくるものは30クローン中1クローンであった事から、30クローンを1プールとして細胞に一過性に発現させ、目的の発現パターンを示すプールからクローニングする方法が最も効率的であると考えられた。次に、これら特異的局在を示すクローンの塩基配列を解析した。GFP融合タンパク質を定常発現させた細胞からRT-PCRにより得られたPCR産物の塩基配列を調べたところ、α-amylase, SMG-A, VCS-β1と相同性をもつクローンが得られた。また、一過性発現法により得られたプラスミドクローンの塩基配列を解析したところ、SMG-A, VCS-β1,DNase Iと相同性を持つクローンが得られた。α-amylase, SMG-A, VCS-β1は耳下腺細胞に発現することが報告されており、この方法により耳下腺細胞に発現するクローンを単離できることが示された。しかし、中には予測と異なる細胞内局在を示す分子も認められた。特に、cDNA部分が短いクローンが予測と異なる局在を示すことから、効率的に完全長のクローンを作製する工夫が重要であると考えられる。

The secretion of water and electrolyte in auricular gland cells, the secretion of Ca^<2+>, PKC and PKA, the regulation of the downstream information transmission mechanism, and the regulation of the downstream information transmission mechanism. In this study, we investigated the molecular groups involved in the information transmission and control of auricular gland cells. The development of Visual Screening was attempted for the development of GFP fusion protein, which was derived from cDNA fragments and contained genes, and for the detection of unknown proteins in all regions. The method of transient occurrence is tried out, the efficiency is compared, and the efficiency is compared. The specific situation is shown in the form of GFP and fusion in the form of 30 frames, 1 frame in the form of 30 frames, and 1 frame in the form of 30 frames. Second, the special situation in the analysis of the basic arrangement GFP fusion protein is constantly expressed in cells from RT-PCR to PCR products and gene alignment is regulated by the identity of α-amylase, SMG-A, VCS-β1. The transient detection method is used to analyze the base alignment of SMG-A, VCS-β1,DNase I and identity.α-amylase, SMG-A, VCS-β1 is expressed in auricular gland cells. In the middle of the cell, there is a molecular recognition. In particular, the cDNA part is short and different, and the time required to control the cDNA part is important.