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ビジュアルスクリーニング法を用いた耳下腺細胞の新規シグナル分子の検索と機能解析

目视筛选法寻找腮腺细胞中新型信号分子并进行功能分析

基本信息

批准号：
15791066
负责人：
森田貴雄
金额：
$ 2.18万
依托单位：
Health Sciences University of Hokkaido
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
财政年份：
2003
资助国家：
日本
起止时间：
2003 至 2005
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-15791066/
关键词：
GFP 耳下腺腺房細胞可視化細胞内局在アミラーゼ SMG IP_3受容体 Ca^<2+>流入

项目摘要

耳下腺腺房細胞における水・電解質分泌やタンパク質の開口分泌はCa^<2+>、PKC、PKAなどで調節されるが、その下流の情報伝達機構や転写調節機構は明らかにされていない。本研究は、耳下腺腺房細胞の情報伝達や転写制御に関与する分子群を明らかにすることを目的とする。ラット耳下腺由来cDNAライブラリーに含まれる遺伝子をGFP融合タンパク質として発現させ、それらの局在を指標にして未知のタンパク質を検索するVisual Screeningの開発を試みた。いくつかのスクリーニング法を試行し、その効率を比較検討したところ、定常発現法より一過性発現法によるスクリーニングが効率的であると考えられた。特異的局在を示し、frameが合う形でGFPと融合タンパク質をつくるものは30クローン中1クローンであった事から、30クローンを1プールとして細胞に一過性に発現させ、目的の発現パターンを示すプールからクローニングする方法が最も効率的であると考えられた。次に、これら特異的局在を示すクローンの塩基配列を解析した。GFP融合タンパク質を定常発現させた細胞からRT-PCRにより得られたPCR産物の塩基配列を調べたところ、α-amylase, SMG-A, VCS-β1と相同性をもつクローンが得られた。また、一過性発現法により得られたプラスミドクローンの塩基配列を解析したところ、SMG-A, VCS-β1,DNase Iと相同性を持つクローンが得られた。α-amylase, SMG-A, VCS-β1は耳下腺細胞に発現することが報告されており、この方法により耳下腺細胞に発現するクローンを単離できることが示された。しかし、中には予測と異なる細胞内局在を示す分子も認められた。特に、cDNA部分が短いクローンが予測と異なる局在を示すことから、効率的に完全長のクローンを作製する工夫が重要であると考えられる。

Subauricular gland cells secrete water and electrolytes, secrete Ca^<2+>, PKC, PKAなどでregulationされるが、そのdegradationのinformation伝达Mechanismや転WRITING regulating mechanismは明らかにされていない. In this study, the purpose of this study was to write down the information about the subauricular gland cells and the molecular groups. cDNA derived from ラットsubauricular gland, ライブラリーにcontaining まれる缝子をGFP fusion タンパク性として発出させ、それらの区在をINDICATOR にしてUNKNOWN のタンパク性を検SOするVisual Screeningの开発をtrialみた.いくつかのスクリーニング法をtrial implementationし、そのefficiencyを comparative studyしたところ、steadiness The method of 発appear is a temporary method of 発appearing and it is efficient. The unique structure is the frame, the frame, the shape, the GFP, and the fused quality.つくるものは30クローン中1クローンであった事から、30クローンを1プールとしてCell にTransient に発appears させ、Purpose の発appears パターンを indication The すプールからクローニングする method is the most efficient one. The specific situation of the sub- and これら is shown in the すクローンの塩base arrangement をanalytic した. GFP fusion タンパクquality を regular 発appears させたcell からRT-PCR によりget られたPCR product の塩组array べたところ, α-amylase, SMG-A, VCS-β1 is the same as the original one.また、Transient 発appearance method により得られたプラスミドクローンの塩basearrayをanalytic したところ、SMG-A, VCS-β1,DNase I am the same as I am. α-amylase, SMG-A, Report on VCS-β1 subauricular gland cell development and prescription The method is to use the subauricular gland cells to show the appearance of the subauricular gland cells.しかし、中には Predicted and different なる cells are localized を Show す molecules も recognize められた. Special, cDNA part is short and is predicted to be different. , Efficiency is the key to long-term production and time-consuming work.