ビジュアルスクリーニング法を用いた耳下腺細胞の新規シグナル分子の検索と機能解析

点击翻译按钮获取中文摘要

耳下腺腺房細胞における水・電解質分泌やタンパク質の開口分泌はCa^<2+>、PKC、PKAなどで調節されるが、その下流の情報伝達機構や転写調節機構は明らかにされていない。本研究は、耳下腺腺房細胞の情報伝達や転写制御に関与する分子群を明らかにすることを目的とする。ラット耳下腺由来cDNAライブラリーに含まれる遺伝子をGFP融合タンパク質として発現させ、それらの局在を指標にして未知のタンパク質を検索するVisual Screeningの開発を試みた。いくつかのスクリーニング法を試行し、その効率を比較検討したところ、定常発現法より一過性発現法によるスクリーニングが効率的であると考えられた。特異的局在を示し、frameが合う形でGFPと融合タンパク質をつくるものは30クローン中1クローンであった事から、30クローンを1プールとして細胞に一過性に発現させ、目的の発現パターンを示すプールからクローニングする方法が最も効率的であると考えられた。次に、これら特異的局在を示すクローンの塩基配列を解析した。GFP融合タンパク質を定常発現させた細胞からRT-PCRにより得られたPCR産物の塩基配列を調べたところ、α-amylase, SMG-A, VCS-β1と相同性をもつクローンが得られた。また、一過性発現法により得られたプラスミドクローンの塩基配列を解析したところ、SMG-A, VCS-β1,DNase Iと相同性を持つクローンが得られた。α-amylase, SMG-A, VCS-β1は耳下腺細胞に発現することが報告されており、この方法により耳下腺細胞に発現するクローンを単離できることが示された。しかし、中には予測と異なる細胞内局在を示す分子も認められた。特に、cDNA部分が短いクローンが予測と異なる局在を示すことから、効率的に完全長のクローンを作製する工夫が重要であると考えられる。