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イノシトールリン脂質を介したエンドサイトーシス制御機構の解明

阐明肌醇磷脂介导的内吞控制机制

基本信息

批准号：
13780567
负责人：
伊藤俊樹
金额：
$ 1.28万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
财政年份：
2001
资助国家：
日本
起止时间：
2001 至 2002
项目状态：
已结题

项目摘要

昨年度の本研究において明らかにした、新規epsinファミリーに属するKIAA0171のさらに詳細な機能解析を行った。KIAA0171の細胞内局在は、クラスリンだけでなく、トランスゴルジ網(TGN)輸送に関与するアダプタータンパク、AP-1と一致した。また、その一部はエンドソームの融合によって生じるMVB(multi-vesicular body)構造の周縁部に沿って局在することが観察された。実際、in vitroでのpull-down assay及びoverlay assayにより、KIAA0171は一次構造中央部においてクラスリン重鎖、及びγ-adaptinと結合することが明らかとなった。さらに詳細な部分コンストラクトを作製し、検討したところ、これらの結合はそれぞれ、(1)KIAA0171の「SGDLVDLSGDLVDLGFVG」配列とクラスリン重鎖末端ドメイン、及び(2)KIAA0171の「GNGDFGDWSA」配列とγ-adaptinのearドメインとの相互作用によるものであることが明らかとなった。次に、KIAA0171の細胞内局在とENTHドメインの関係を明らかにするべく、さまざまな変異型コンストラクトをGFP融合タンパクとしてCOS7細胞内に発現し、その細胞内局在を検討した。ENTHドメインを欠損するとKIAA0171のTGN周辺への局在が観察されないことは昨年度に明らかにしていたが、脂質結合に必須の67番ArgをAlaに置換した変異体も同様に、細胞質中に分散する異常な局在パターンを示した。驚くべきことに、ENTHドメインのみをGFP融合タンパクとして発現させると単独でTGNに局在できることが観察され、その局在は67番Arg変異型ENTHドメインでは観察されなかった。

The detailed function analysis of KIAA0171 was carried out in the research of the last year. KIAA0171's intracellular distribution is consistent with that of AP-1 and TGN. The structure of MVB(multi-vesicular body) is composed of two parts: one part of MVB and the other part of MVB. In practice, pull-down assay and overlay assay in vitro, KIAA0171 primary structure central part, and γ-adaptin combination (1) SGDLVDLSGDLGFVG configuration of KIAA0171 and (2) GNGDFGDWSA configuration of KIAA 0171 and γ-adaptin ear configuration of KIAA0171. In addition, KIAA0171's intracellular structure is clearly related to ENTH, GFP fusion, and other intracellular structures are discussed. ENTH is not available until the end of 2017, when the TGN cycle was interrupted. In the meantime, the heart of the ENTH German medical element has been revealed by GFP fusion and is now visible in TGN alone, and the other part of the 67-Arg variant of the ENTH German medical element is visible.