イノシトールリン脂質を介したエンドサイトーシス制御機構の解明

阐明肌醇磷脂介导的内吞控制机制

基本信息

批准号：
13780567
负责人：
伊藤俊樹
金额：
$ 1.28万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
财政年份：
2001
资助国家：
日本
起止时间：
2001 至 2002
项目状态：
已结题

项目摘要

昨年度の本研究において明らかにした、新規epsinファミリーに属するKIAA0171のさらに詳細な機能解析を行った。KIAA0171の細胞内局在は、クラスリンだけでなく、トランスゴルジ網(TGN)輸送に関与するアダプタータンパク、AP-1と一致した。また、その一部はエンドソームの融合によって生じるMVB(multi-vesicular body)構造の周縁部に沿って局在することが観察された。実際、in vitroでのpull-down assay及びoverlay assayにより、KIAA0171は一次構造中央部においてクラスリン重鎖、及びγ-adaptinと結合することが明らかとなった。さらに詳細な部分コンストラクトを作製し、検討したところ、これらの結合はそれぞれ、(1)KIAA0171の「SGDLVDLSGDLVDLGFVG」配列とクラスリン重鎖末端ドメイン、及び(2)KIAA0171の「GNGDFGDWSA」配列とγ-adaptinのearドメインとの相互作用によるものであることが明らかとなった。次に、KIAA0171の細胞内局在とENTHドメインの関係を明らかにするべく、さまざまな変異型コンストラクトをGFP融合タンパクとしてCOS7細胞内に発現し、その細胞内局在を検討した。ENTHドメインを欠損するとKIAA0171のTGN周辺への局在が観察されないことは昨年度に明らかにしていたが、脂質結合に必須の67番ArgをAlaに置換した変異体も同様に、細胞質中に分散する異常な局在パターンを示した。驚くべきことに、ENTHドメインのみをGFP融合タンパクとして発現させると単独でTGNに局在できることが観察され、その局在は67番Arg変異型ENTHドメインでは観察されなかった。

去年，属于新Epsin家族的KIAA0171进行了更详细的功能分析。 KIAA0171的亚细胞定位与AP-1一致，AP-1是一种参与反式高尔基网络（TGN）转运和网格蛋白的衔接蛋白。还观察到，其中一些位于内体融合产生的多维体（MVB）结构的外围。实际上，在体外进行下拉和覆盖分析表明，KIAA0171与主要结构中央部分中的网格蛋白重链和γ-适应素结合。 More detailed partial constructs were prepared and investigated, and it was revealed that these bindings were due to interactions between (1) the "SGDLVDLSGDLVDLGFVG" sequence of KIAA0171 and the clathrin heavy chain terminal domain, and (2) the "GNGDFGDWSA" sequence of KIAA0171 and the ear domain of γ-adaptin, respectively.接下来，为了阐明KIAA0171的亚细胞定位与ENTH结构域之间的关系，各种突变构建体在COS7细胞中表示为GFP融合蛋白，并检查了其亚细胞定位。去年据透露，当恩域域缺乏时，没有观察到KIAA0171在TGN周围的定位，但是在脂质结合所必需的arg 67的突变体被ALA取代，类似地表现出了在细胞质中分散的异常定位模式。令人惊讶的是，据观察，单独作为GFP融合蛋白可以定位于TGN的表达，并且在Arg突变体源域67中未观察到定位。