細胞膜受容体のエンドサイトーシスによる細胞増殖制御機構の解明

通过细胞膜受体的内吞作用阐明细胞增殖控制机制

• 批准号: 14028017
• 负责人: 伊藤 俊樹
• 金额: $ 4.35万
• 依托单位: The University of Tokyo
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• 财政年份: 2002
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2002 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-14028017/
• 关键词: epsin; トランスゴルジ網; クラスリン; ENTHドメイン; AP-1; イノシトールリン脂質

(1)AP180のENTHドメインがPI(4,5)P_2に最も強く結合することを確認した。その後、epsinにおいて脂質結合に必須である63番Arg、76番Lysにそれぞれ相当する各残基、66番Arg、77番LysをAlaに置換すると、PI(4,5)P2結合能を失った。次に、AP180、CALM及びHip1Rの全長タンパクをGFP融合タンパクとしてCOS7細胞内に発現すると、クラスリンと共局在する小胞状の構造が観察された。中でもHip1Rを含む小胞は、細胞膜直下においてアクチン繊維束に沿って分布することから、エンドサイトーシスとアクチン細胞骨格を結ぶキータンパクである可能性が示唆された。(2)Epsinファミリーに属する新規タンパクKIAA0171の機能解析を行った。まず、ENTHドメインに対する各イノシトールリン脂質との結合アッセイを行ったところ、PI(4,5)P2に最も強く結合した。GFP融合タンパクをCOS7細胞内に発現したところ、その細胞内局在はクラスリン、およびTGN輸送に関与するアダプタータンパク、AP-1と一致し、その一部はMVB (multi-vesicular body)構造の周縁部に沿って局在することも観察された。次に、さまざまな変異型コンストラクトをGFP融合タンパクとしてCOS7細胞内に発現し、その細胞内局在を検討した。ENTHドメインを欠損すると、KIAA0171のTGN周辺への局在は観察されず、細胞質中に分散する小胞状の局在を示した。脂質結合に必須の67番ArgをAlaに置換した変異体も同様の異常な局在パターンを示した。逆に、ENTHドメインのアミノ末端にミリスチン酸化シグナルを付加した膜結合型変異体ではTGN周辺への集積が促進された。さらに驚くべきことには、ENTHドメインのみをGFP融合タンパクとして発現させると単独でTGNに局在できることが観察され、その局在は67番Arg変異型ENTHドメインでは観察されなかった。

(1)AP180 <s:1> ENTHドメ が がPI(4,5)P_2に the most <s:1> strong く combination する とを とを とを confirmation た た. , after そ の epsin に お い て lipid must combine に で あ る 63 Arg, and 76 times Lys に そ れ ぞ れ quite す る each residue, 66 Arg, and 77 times Lys を Ala に replacement す る と, PI (4, 5) P2 binding energy を lost っ た. Time に, AP180, reflux and び Hip1R の span タ ン パ ク を GFP fusion タ ン パ ク と し て in COS7 cells に 発 now す る と, ク ラ ス リ ン と total bureau in す る small cellular の tectonic が 観 examine さ れ た. In で も Hip1R を は む small cell, cell membrane by に お い て ア ク チ ン 繊 d beam に along っ て distribution す る こ と か ら, エ ン ド サ イ ト ー シ ス と ア ク チ ン cells bone を "ぶ キ ー タ ン パ ク で あ が る possibility in stopping さ れ た. (2)Epsinファ ファ リ に に に is part of the する new regulation タ パ パ パ KIAA0171. Function analysis を line った. ま ず, ENTH ド メ イ ン に す seaborne る each イ ノ シ ト ー ル リ ン lipid と の combining ア ッ セ イ を line っ た と こ ろ, PI (4, 5) P2 に most strong も く combining し た. GFP fusion タ ン パ ク を COS7 cell に 発 now し た と こ ろ, そ の cells inside bureau in は ク ラ ス リ ン, お よ び TGN conveying に masato and す る ア ダ プ タ ー タ ン パ ク, AP - 1 と consistent し, そ の a は MVB (multi - vesicular The body) structure the に surrounding part に along the って bureau is located at the する と と 観 観 された. に, さ ま ざ ま な - alien コ ン ス ト ラ ク ト を GFP fusion タ ン パ ク と し て in COS7 cells に 発 し, そ の cells inside bureau in を beg し 検 た. ENTH ド メ イ ン を owe loss す る と, KIAA0171 の TGN weeks 辺 へ の bureau in は 観 examine さ れ ず に dispersed, the cytoplasm す る small cellular の bureau at を し た. Lipid binding に must <s:1> 67-arg をAlaに displacement <s:1> た variant <s:1> the same <s:1> anomaly な in パタ and <s:1> を を を show た た. Inverse に, ENTH ド メ イ ン の ア ミ ノ end に ミ リ ス チ ン acidification シ グ ナ ル を plus し た type membrane bound - variant で は TGN weeks 辺 へ の set product が promote さ れ た. さ ら に surprised く べ き こ と に は, ENTH ド メ イ ン の み を GFP fusion タ ン パ ク と し て 発 now さ せ る と 単 で alone the TGN に bureau in で き る こ と が 観 examine さ れ, そ の bureau in 67's は Arg - alien ENTH ド メ イ ン で は 観 examine さ れ な か っ た.

项目成果

Toshiki Itoh, Tadaomi Takenawa: "Phosphoinositide-binding domains : Functional units for temporal and sptial regulation of intracellular signalling"Cellular Signalling. 14・9. 733-743 (2002)

Toshiki Itoh，Tadaomi Takenawa：“磷酸肌醇结合结构域：细胞内信号传导的时间和空间调节的功能单元”Cellular Signalling 14・9（2002）。

Makiko Otsuki, Toshiki Itoh, Tadaomi Takenawa: "N-WASP is recruited to rafts and associates with endophilin A in response to EGF"The Jounal of Biological Chemistry. (In press). (2003)

Makiko Otsuki、Toshiki Itoh、Tadaomi Takenawa：“N-WASP 被募集到筏上并与内亲素 A 结合以响应 EGF”《生物化学杂志》。