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Osteoclast fusion mechanism based on plasma membrane curvature and tension

基于质膜曲率和张力的破骨细胞融合机制

基本信息

批准号：
22H02574
负责人：
伊藤俊樹
金额：
$ 11.15万
依托单位：
Kobe University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
财政年份：
2022
资助国家：
日本
起止时间：
2022-04-01 至 2025-03-31
项目状态：
未结题

项目摘要

RAW264.7細胞をRANKL刺激し、光ピンセット顕微鏡を用いて細胞膜張力を測定・比較した。その結果、はRANKL刺激による破骨細胞分化誘導により、未刺激細胞に比べて優位に細胞膜張力が低下していることが明らかとなった。また、細胞膜張力の発生を反映するERMファミリータンパク質のリン酸化抗体を用いた細胞染色により、RANKL刺激後のリン酸化ERMレベルを測定したところ、破骨細胞分化に伴ってERMタンパク質のリン酸化が減弱していることが観察された。また、細胞膜張力を恒常的に上昇させるため、活性型ezrinを安定的に発現させたRAW264.7細胞株においては、細胞膜張力の低下が起こらないことが観察された。これらの結果は、細胞膜張力の抑制が細胞融合に必要であることを示唆している。次に、ERMファミリータンパク質のノックダウンによる発現抑制実験により、細胞膜張力と細胞融合の関係を検討した。その結果、ERMノックダウン細胞ではコントロール細胞と比較して、RANKL刺激後70時間において細胞融合が促進することが観察された。興味深いことに、野生型RAW264.7細胞を用いてRANKL刺激後の細胞ライセートを抽出し、各ERMファミリータンパク質の発現レベルを比較したところ、ezrinのタンパク量が著しく減弱していた。プロテアソーム阻害剤であるMG132処理による影響は見られなかった。さらに、reverse-transcription PCR法によるmRNAレベルでの比較においてもezrinの発現は減少していた。これらの結果から、ERMファミリータンパク質のうち、ezrinが破骨細胞分化誘導において転写レベルでの制御を受けており、それに伴う細胞膜張力の減少が破骨細胞融合に寄与することが示唆された。

RAW264.7 cells were stimulated by RANKL, and the cell membrane tension was measured and compared by microscopy. As a result, osteoclast differentiation induced by RANKL stimulation was lower than that induced by unstimulated cells. The expression of ERM in cell membrane tension was detected by cell staining, ERM in cell membrane tension was detected by RANKL stimulation, ERM in cell membrane tension was detected by cell staining. In RAW264.7 cell line, a steady increase in cell membrane tension was observed. As a result, inhibition of cell membrane tension is necessary for cell fusion. The relationship between cell membrane tension and cell fusion is discussed. The results showed that ERM could promote cell fusion 70 days after RANKL stimulation. The expression of ezrin in RAW264.7 cells stimulated with RANKL was significantly lower than that in control cells. MG132 is a very effective way to deal with this problem. In addition, reverse-transcription PCR method can reduce the expression of ezrin. The results showed that osteoclast differentiation induced by ERM was inhibited by ERM, which was accompanied by decrease of cell membrane tension and fusion of osteoclasts.