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活性中心の改変による新しいグリコシラーゼの作製

通过修饰活性中心创建新的糖基化酶

基本信息

批准号：
13876018
负责人：
木村淳夫
金额：
$ 1.34万
依托单位：
Hokkaido University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Exploratory Research
财政年份：
2001
资助国家：
日本
起止时间：
2001 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-13876018/
关键词：
α-グルコシダーゼグリコシンターゼオリゴ糖合成

项目摘要

α-グルコシダーゼは、α-グルコシド結合をもつ基質に作用し、グルコースを遊離させる酵素である。転移反応では、α-グルコシル基を移し、有用な二糖類であるイソマルトースやニゲロースが工業的に生産されている。本酵素は、一次構造や基質認識が異なる2つのグループ(ファミリーIとII)に分類できる。触媒反応は、2つのカルボキシル基(_-COO^-と_-COOH)でなされ、この点では両ファミリーともに共通である。我々は、ファミリーI・II酵素の触媒残基(酸性アミノ酸)を自殺基質法や点突然変異法で決定した。II型酵素の_-COO^-である触媒基AspをAsn・Ala・Glyに置換した変異酵素は、加水分解反応を触媒できないが、活性中心の構造に大きな変化はない。最近、我々は触媒基AspのGly組換え酵素に糖転移活性が存在することを見い出した。本変異酵素は糖転移のみを一方的に行い、転移生成物を分解しない。本研究の目的は、新しく見い出されたこの現象を解析することであり、次に示す研究成果が得られた。(1)Asp→Ala酵素では本現象が認められず、Asp→Gly酵素のみが本反応を触媒した。Alaより小さなアミノ酸残基への置換が有効であった。(2)β-グルコシルフルオリドが第一基質となったが、α-グルコシルフルオリドでは反応が生じなかった。野生型酵素はα-型基質に作用するので、変異酵素の基質認識は逆転していた。従って、反応機構は縮合であると考えられた。(3)第二基質には、p-ニトロフェニル(PNPと略)α-グルコシド、α-キシロシド、α-マンノシドおよびβ-グルコシドが利用された。マルトースやPNPα-ガラクトシドには作用しなかった。PNPα-グルコシドの場合、約70%の高収率でPNPα-マルトシドとα-イソマルトシドが得られた。(4)現在、I型α-グルコシダーゼ、β-グルコシダーゼやα-ガラクトシダーゼについても本現象の解析を行っている。

α-glucuronidase, α-glucuronidase In addition, the production process of industrial products can be carried out in the following ways: The enzyme is classified into two groups: primary structure and substrate recognition. The catalyst reaction system is composed of two groups (_-COO^-_-COOH). The catalytic residues of enzyme I and II (acidic and acidic) are determined by the suicide matrix method and the point mutation method. Type II enzyme_-COO^-Asn·Ala·Gly Recently, we have seen the presence of sugar transfer activity in the catalytic Asp group. This enzyme is responsible for the degradation of sugar and its products. The purpose of this study is to analyze the phenomenon and to show the results of this study. (1)Asp→Ala enzyme is a catalyst for this phenomenon. Ala (2)β-cell phone number is the first base, α-cell phone number is the second base. Wild-type enzymes act on α-type substrates, while heteroenzymes recognize substrates in reverse.従って、反応机构は缩合であると考えられた。(3)The second matrix is PNP, α-PNP, and β-PNP. PNPα- PNPα-solidarity-based field combination, about 70% of the high yield of PNPα-solidarity-based field combination (4)Now, I type α-glucuronidase, β-glucuronidase and α-glucuronidase have been studied.