ニワトリ初期胚を用いたマウス胚性幹(ES)細胞の肝細胞へのin ovo分化誘導

使用早期鸡胚胎将小鼠胚胎干 (ES) 细胞在卵内分化为肝细胞

基本信息

批准号：
13877085
负责人：
吉川正英
金额：
$ 1.34万
依托单位：
Nara Medical University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Exploratory Research
财政年份：
2001
资助国家：
日本
起止时间：
2001 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

ドナー肝の不足は肝移植治療普及の大きな障害である。本研究は、マウスES細胞をニワトリ初期胚の肝臓原基領域(前腸)内に移植し、トリ肝発生の自然のプログラムに同調させてマウス由来の細胞から3次元的かつ機能的肝臓を形成させることを目的として計画した。あらかじめGFP蛍光標識したES細胞より作製した胚様体をトリ胚前腸腹側上皮部に移植したところ、形成されつつあるトリ肝臓内にマウス細胞に由来することを示すGFP蛍光を発する細胞が存在した。肝細胞や赤血球系細胞は自然自己蛍光を発するが、それらとは異なる強い蛍光で、陽性細胞の一部は幼若肝細胞様であった。血液系と思われるGFP陽性細胞も存在した。Feulgen染色によるマウスおよびトリ細胞の識別も取り入れ、現在マウスES細胞由来の分化細胞のキヤラクタリゼーションを行っている。さらに、本研究過程で、ES細胞はin vitroでも胚体内胚葉系細胞に分化させ得ることが判明した。本研究申請準備中の平成12年10月時点においては、ES細胞が外胚葉、中胚葉系細胞には分化するとの豊富な報告があったが、胚内内胚葉系細胞への分化の明確な報告は無かった。我々は、ES細胞の分化誘導に独自の胚様体形成法を用い、その頻度はわずかではあるが、ES細胞が腸管上皮細胞や肝細胞さらに膵内分泌細胞へ分化することを確認した。hanging drop法により形成した胚様体をゼラチンコートシャールにて付着性培養を行ったところ、4-5日目ごろより心筋線維群が観察され、14日目ごろより、ICGに染色される細胞集団が心筋線維群近傍に多く出現した。このICG陽性細胞には肝細胞機能関連の多種遺伝子発現が認められ、電顕観察でも滑面・粗面小胞体、ミトコンドリア、ペルオキシゾームなど細胞内器官がよく発達、さらに隣接細胞間には毛細胆管様構造が形成され、「肝細胞」と考えられた。胚体内内胚葉系細胞として肝細胞の以外にも、前述のごとく膵内分泌細胞群や腸管上皮様細胞への分化も確認した。

供体肝脏缺乏是肝移植治疗传播的主要障碍。这项研究旨在将小鼠ES细胞移植到早期鸡胚胎的肝脏原始区域（前肠），并与禽肝发育的自然程序保持一致，以形成来自来自小鼠的细胞的三维和功能性肝。当提前用GFP荧光标记的ES细胞制备的胚胎物体植入了禽类胚胎的腹侧上皮时，有一些细胞在形成的鸟肝中排放GFP荧光，表明它们是从小鼠细胞中得出的。肝细胞和红细胞细胞发出天然自动荧光，但它们与之不同，一些阳性细胞类似于幼体肝细胞。也有GFP阳性细胞，被认为是血液系统。它还通过Feulgen染色结合了小鼠和鸟类细胞的鉴定，目前正在对衍生自小鼠ES细胞的分化细胞进行耗能。此外，在这项研究过程中，发现ES细胞可以在体外区分到确定的内胚层细胞。截至2000年10月，在为这项研究的准备过程中，有大量的报道将ES细胞分化为外胚层和中胚层细胞，但没有明确的报道说明胚胎胚胎细胞中内胚层细胞分化为内胚层细胞。我们使用独特的胚胎形成方法来诱导ES细胞的分化，尽管它很小，但我们证实ES细胞分化为肠上皮细胞，肝细胞甚至胰腺内分泌细胞。当使用明胶涂层的薄片依附地培养了由悬挂液滴法形成的胚胎体时，从大约4-5天开始观察到心肌纤维基团，从大约14天开始，从心肌纤维组附近出现了大量用ICG染色的细胞。这些ICG阳性细胞表现出与肝细胞功能相关的多基因表达，电子显微镜观察结果表明，诸如平滑而粗糙的内质网，线粒体，线粒体和过氧化物酶体等细胞内器官和毛细血管样结构都很好地形成了它们之间，因此被认为是校正细胞之间的。如上所述，除了肝细胞为确定体内的内胚细胞外，还已经确认了分化为胰腺内分泌细胞和肠上皮样细胞的分化。