放線菌におけるグルコースによる形態分化抑制機構の解明

阐明葡萄糖抑制放线菌形态分化的机制

基本信息

批准号：
02F00215
负责人：
堀之内末治
金额：
$ 1.34万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2002
资助国家：
日本
起止时间：
2002 至 2003
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-02F00215/
关键词：
放線菌グルコース制御形態分化二次代謝分泌酵素

项目摘要

放線菌の二大特徴である形態分化と二次代謝は、グルコースによるカタボライト抑制を受け、この機構の解明は放線菌の基礎的・応用的理解に極めて重要である。1.生化学的手法を用いたGlkA結合蛋白の探索グルコースによるカタボライト抑制にはグルコースキナーゼGlkAが必須であることが知られている。これに基づき、アフィニティークロマトグラフィーによってStreptomyces griseus総蛋白からGlkA結合蛋白の探索を行った。現在、結合蛋白の候補として10本のSDS-PAGEバンドが得られている。このうち1本に関してN末端アミノ酸配列解析を行い、S.coelicolorの蛋白データベースと照合したところ、これはSCD95A.14と高い相同性を持つ蛋白のバンドである可能性が示唆された。残りの9本のSDS-PAGEバンドに関しては、今後順次N末端アミノ酸配列解析を行う。2.遺伝学的手法を用いたグルコースカタボライト抑制に関わる遣伝子群の探索ショットガンクローニング法を用い、グルコースカタボライト抑制に関わる遺伝子群の探索を行った。S.griseus変異株であるVHK4株を宿主とし、S.griseus野生株の遺伝子断片ライブラリーを低コピーベクターを用いて導入した。VHK4株は、胞子形成に関してグルコースカタボライト抑制が生じない、すなわち野生株では胞子形成に至らない高濃度グルコース培地にて胞子形成に至る変異株である。高濃度グルコース含有培地にて胞子形成に至らなくなった株を選別した結果、約3,000株の遺伝子導入体から1株の目的遺伝子保持候補株が得られた。これに関して遺伝子配列を決定した結果、この配列は約1.0kbであり、1つの完全orf及びC末端、N末端にそれぞれ部分orfを持つ部分に該当することが判明した。今後、この蛋白に関する表現型の観察を行う。さらに、S.griseus野生株を宿主とし、S.griseus野生株自身の遺伝子断片ライブラリーを高コピーベクターを用いて導入した。高濃度グルコース含有培地にて胞子形成に至るようになった株を選別した結果、約6,000株の遺伝子導入体から2株の目的遺伝子保持候補株が得られた。今後、これらの配列に関して、真にグルコースカタボライト抑制に関わる遺伝子の同定を行い、その機能を解析する。

形态学分化和继发代谢是放线菌的两个主要特征，受到葡萄糖的分解代谢产物的抑制作用，对这种机制的阐明对于对放线菌的基本和应用的理解非常重要。 1。使用生化技术搜索GLKA结合蛋白，众所周知，葡萄糖激酶GLKA对于通过葡萄糖抑制分解代谢物至关重要。基于此，我们通过亲和力色谱法搜索了Glka结合蛋白来自链霉菌的总蛋白。目前，已获得10个SDS-PAGE带作为候选结合蛋白。分析了其中一个细胞中的N末端氨基酸序列，并将其与Coelicolor链球菌的蛋白质数据库进行了比较，并建议这可能是具有高质量同源性SCD95A.14的蛋白质带。将来将按顺序分析其余的九个SDS-PAGE频段。 2。搜索使用遗传技术参与葡萄糖分解代谢物抑制的敏化剂组，我们使用shot弹枪克隆方法来搜索涉及葡萄糖分解代谢物抑制的基因。 S.griseus突变菌株VHK4被用作宿主，并使用低拷贝载体引入了S.Griseus野生应变的基因片段。 VHK4菌株是一种突变体，不会在孢子形成中引起葡萄糖分解代谢产物抑制，也就是说，在高浓度的葡萄糖培养基中不会导致野生菌株的孢子形成，这不会导致孢子。由于选择未达到含有高浓度葡萄糖的培养基的菌株，从大约3,000个基因转染的菌株中获得了一个靶基因的菌株。在这方面确定了基因序列，并发现该序列约为1.0 kb，并且对应于一个完整的ORF，以及在C末端和N末端的部分ORF的一部分。将来，我们将观察有关该蛋白质的表型。此外，使用高拷贝载体引入了S.Griseus野生应变作为宿主，并引入了S.Griseus野生菌株本身基因片段。由于选择导致含有高浓度葡萄糖的培养基中孢子形成的菌株，从大约6,000个基因转染的菌株中获得了两个靶基因菌株。将来，将针对这些序列确定真正参与葡萄糖分解代谢物抑制的基因，并将分析其功能。