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放線菌ストレプトミセス・グリセウスのゲノム解析のための基盤整備

放线菌灰色链霉菌基因组分析的基础设施开发

基本信息

批准号：
12206022
负责人：
堀之内末治
金额：
--
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (C)
财政年份：
2000
资助国家：
日本
起止时间：
2000 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-12206022/
关键词：
ゲノムライブラリー放線菌 Streptomyces griseus 形態形成抗生物質生産

项目摘要

放線菌は多種多様な生理活性物質の生産菌として重要な工業微生物であるとともに、細胞の形態分化のモデル生物として基礎生物学の格好の材料である。我々の大きな目標は、ストレプトマイシン生産菌であるS.griseus IFO 13350株の全ゲノム配列(8Mb)を決定することであるが、その前段階としてS.griseusゲノムの整列化BACライブラリーを作製した。S.griseus染色体DNAをBamHIで部分分解後パルスフィードル電気泳動により分画し、約100kb以上のDNA断片をBACベクター(pBeloBAC11)にクローニングし、1440クローンからなるBACライブラリー(平均インサーション約80kb)を構築した。T7およびSP6RNAポリメラーゼを用いたin vitro転写により、任意のクローンの挿入DNA両末端に対するdigoxigeninラベルRNAプローブを作製し、BAC DNAを固定したナイロンメンブレンを用いたハイブリダイゼーションにより、そのクローンとオーバーラップするDNAを持つクローンを選択した。総計624クローンを用いてこの操作を繰り返すことによって、174クローンからなる整列化BACライブラリーが構築できた。本整列化BACライブラリーは4つのギャップ領域が存在するものの、ゲノムのほぼ全長をカバーしていると考えられる。現在、染色体DNAのDraI,AseI断片をラベルし、整列化BACクローン群とハイブリダイゼーションを行なうことによって、DraI、AseIによるゲノムの制限酵素地図を作製するとともに、整列化BACクローン群の染色体上での位置の特定を進めている。一方、A-ファクター制御カスケード内の役者を同定するために、カスケード内の転写因子AdpAが結合するDNA断片をゲルシフト-PCR法にて20種以上取得した。取得したDNA断片を含む大きなDNA断片をクローニング、塩基配列決定による遺伝子の同定、A-ファクター依存性の転写の有無を確認した。その中の1つは、外界の環境変化に応答して転写を起こすシグマ因子をコードしていた。このシグマは、二次代謝には関係せず、形態分化にのみ関係していた。

Actinomycetes are important bacteria that produce a variety of physiologically active substances, are important industrial microorganisms, and are good materials for morphological differentiation of cells and basic biology. I am a big target, a ストレプトマイシン production strain S.griseus IFO 13350 strains of all-in-one arrangement (8Mb) することであるが、その Front section Order としてS.griseus ゲノムのaligned BACライブラリーをproduced した. S.griseus chromosomal DNA was partially decomposed by BamHI, and the DNA fragments of about 100kb or more were separated by electrophoresis and BAC analysis.ター(pBeloBAC11)にクローニングし、1440クローンからなるBACライブラリー(average インサーションapproximately 80kb)をconstructedした. T7およびSP6RNAポリメラーゼを用いたin In vitro転写により、arbitrarily inserted DNAに対するdigoxigeninラベルRNAプローブをproducedし、BAC DNA fixation methodり、そのクローンとオーバーラップするDNAをhold つクローンを选択した.総uke624クローンを用いてこのoperationを粲り回すことによって、 174クローンからなるaligned BACライブラリーがconstructedできた. There is no existence in the field of this integrated BAC programるものの、ゲノムのほぼfull lengthをカバーしていると卡えられる. Now, chromosomal DNA DraI, AseI fragment をラベルし, aligned BAC クローンgroup とハイブリダイゼーションを行なうことによって, DraI, AseI restrict enzymes to limit enzymes to make enzymes, and align BAC enzymes to specific positions on chromosomes. One side, A-ファクターcontrolled カスケード内の伢者を同定するために, カスケード内の転WRITTEN The factor AdpA binds to DNA fragments and can be obtained using more than 20 types of DNA-PCR methods. Obtained DNA fragments containing large DNA fragments, をクローニング, and base alignment determination A-ファクターdependency の転WRITE の有无をconfirm した.その中の1つは、The external environment changes に応 Answer して転WRITE を起こすシグマfactor をコードしていた.このシグマは, secondary metabolism and morphological differentiation.