ブタ核移植法の開発および遺伝子改変ブタ作出への応用

猪核移植方法的开发及其在转基因猪生产中的应用

• 批准号: 02J10553
• 负责人: 川原 学
• 金额: $ 1.6万
• 依托单位: Tohoku University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2002
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2002 至 2004
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-02J10553/
• 关键词: クローン; 核移植; ブタ; 活性化; 体外成熟培養; MPF; 早期染色体凝縮; 2倍体化; 初期化; 卵子

本研究ではブタ核移植法の確立が極めて重要なポイントとなる。申請書では平成14年度の研究計画において、(1)活性化刺激と(2)卵子の体外成熟培養時間が核移植した胚の発生に及ぼす影響を調べる予定であった。この研究計画に則り、以下の知見を得た。活性化刺激法として、卵内カルシウムイオンの一過性の上昇を引き起こすイオノマイシン、電気刺激(150V/mm,60μsec)、また、サイクリンBレベルの低下を誘起しMPF活性を抑制するシクロヘキシミドをそれぞれ単独で適用した場合と、カルシウムイオン系、サイクリンB抑制系各々でより活性可能が高いものを組み合わせた複合活性化法について検討した。実験の結果、活性化刺激を与えた単為発生卵の胚盤胞期への発生率が最も高かったのはイオノマイシン、電気刺激、シクロヘキシミドこれら3者の複合刺激を施した処理区であった。さらに、顕微注入によって核移植した胚に対しても同様に3者の複合処理を施した場合、単独で活性化した場合よりも有意に高い発生率を示した。以上から、イオノマイシン、電気刺激、シクロヘキシミドの3者複合活性化刺激は核移植した胚の発生率を向上させることが示された。レシピエント卵子の体外成熟培養時間が核移植胚の発生に及ぼす影響を調べた。体外成熟培養36、40、44時間での卵子の成熟率には差がなかった。しかし、36時間体外成熟培養を施した成熟卵子は核移植胚の胚盤胞期までの発生を支持することができなかった。また、40と44時間の体外成熟培養時間では40時間の方が核移植に供した場合有利に高い発生率を引き出すことが明らかになった。また、研究の進行状況から平成15年度の研究計画の内容にも着手した。移植後の核の形態変化を調べ、その形態変化が核移植の発生に及ぼす影響を調べた。その結果、卵子内の成熟促進因子MPFによる核の凝縮が核移植した胚の発生に重要であることが明らかになった。(2)の実験結果とも考慮し、核の初期化にはMPFの高い卵細胞質に核を曝すことが重要であると推察された。以上(1)から(3)の研究成果を踏まえ、平成15年度にはMPF活性と核の初期化との関係を分子レベルで解析し、さらに核移植された胚の個体への発生を確認すべく仮親豚への核移植胚移植を行った。核移植の操作間で、特に核注入操作によってレシピエント卵子内のMPF活性が低下してしまうことをつきとめ、問題解決として操作培地中へのMPF活性維持剤であるカフェインを添加することで活性の低下を防ぐことに成功した。またカフェイン処理によって早期染色体凝縮を起こす核移植胚の割合が高まり、体外での発生率を改善することにも成功した。さらに、リアルタイムPCR法によって未分化特異的遺伝子Oct4の遺伝子発現を解析し、核移植胚のOct4発現が体外受精卵よりも低くなることをつきとめた。しかし、全30回に渡って仮親へ核移植卵を胚移植したが妊娠70日前後で流産してしまい、個体を得ることはできなかった。以上本研究をまとめると、体内での発生能力に課題を残しつつも、体外でのミニブタ体細胞由来核移植卵の発生能力を高めることには成功し、新たな問題を提起するとともに本研究の知見はミニブタクローンの研究領域に貢献するものと考えられる。

This study is very important to establish the method of nuclear transplantation. The application includes the following aspects: (1) activation stimulation;(2) in vitro maturation culture time of eggs; and (3) regulation of embryo development and development during nuclear transfer. This research project is based on the following knowledge. Activation stimulation, transient rise in egg temperature, electrical stimulation (150V/mm,60μsec), high activity, low MPF activity, low MPF activity, low The results showed that the activation stimulation was the highest in the blastoderm cell stage, and the compound stimulation was the highest in the treatment area. In addition, micro-injection, embryo transfer, and other complex treatments were used to increase the survival rate. The above three kinds of compound activation stimulation, namely, nuclear transplantation, embryo survival rate and embryo survival rate, are shown in this paper. The effect of in vitro maturation time on embryo development and embryo development in nuclear transfer was investigated. The maturation rate of oocytes cultured in vitro for 36, 40 and 44 days was different. In vitro maturation of mature eggs at 36 hours supports the development of blastoderm embryos during nuclear transfer. The in vitro maturation time of 40 to 44 hours is favorable for nuclear transplantation, and the survival rate is high. The progress of the research and the contents of the research plan for the 15th year of Heisei have been started. Nuclear morphological changes after transplantation are regulated, and the effects of nuclear morphological changes on the development of nuclear transplantation are regulated. The maturation promoter MPF in the ovum is important for nuclear transfer and embryo development. (2)The results of this study include consideration of nuclear initialization and nuclear exposure in MPF cells. The results of (1) and (3) above were further developed. In 2005, molecular analysis of the relationship between MPF activity and nuclear initiation was performed, and the development of individual embryos from nuclear transfer was confirmed. The MPF activity in the egg is low during nuclear transplantation, especially during nuclear injection. The problem is solved. The MPF activity in the egg is maintained during nuclear transplantation. The activity is low and the MPF activity is prevented successfully. Early chromosome condensation was initiated in nuclear transfer embryos, and the survival rate was improved in vitro. In addition, the gene expression of undifferentiated specific gene Oct4 was analyzed by PCR, and the gene expression of nuclear transferred embryo Oct4 was analyzed by PCR. All 30 cycles of embryo transfer, embryo transfer, abortion, individual transfer The above research has been successful in raising new questions about the development ability of somatic cells derived from nuclear transfer eggs in vitro and has contributed to the field of research.

项目成果

Makoto Osanai, Yuki Taguchi, Nobuyuki Endo, Manabu Kawahara, Hiromichi Matsumoto, Hiroshi Sasada, Eimei Sato: "PORCINE EMBRYONIC STEM CELL LINES ; POSSIBILITY OF MEDICAL APPLICATIONS AND STRATEGY FOR PRODUCTION"Life Science Research. (掲載決定). (2003)

Makoto Osanai、Yuki Taguchi、Nobuyuki Endo、Manabu Kawahara、Hiromichi Matsumoto、Hiroshi Sasada、Eimei Sato：“猪胚胎干细胞系；医疗应用的可能性和生产策略”生命科学研究（2003 年）。

Shinozawa T, Mizutani E, Tomioka I, Kawahara M(申請者), Sasada H, Matsumoto H, Sato E.: "Differential Effect of Recipient Cytoplasm for Microtubule Organization and Preimplantation Development in Reconstituted Rat Embryos with 2-cell Embryonic Cell Nuclear T

Shinozawa T、Mizutani E、Tomioka I、Kawahara M（申请人）、Sasada H、Matsumoto H、Sato E.：“受体细胞质对 2 细胞胚胎细胞核 T 重建大鼠胚胎中微管组织和植入前发育的差异影响”

Manabu Kawahara, Tadashi Mori, Hozumi Tanaka, Hiroshi Sasada, Eimei Sato: "FACTORS AFFECTING THE DEVELOPMENT OF THE RECONSTRUCTED EMBRYOS PRODUCED FROM IN VITRO SYSTEM IN PIGS"Life Science Research. (掲載決定). (2003)

Manabu Kawahara、Tadashi Mori、Hozumi Tanaka、Hiroshi Sasada、Eimei Sato：“影响猪体外系统重建胚胎发育的因素”（出版）。