新規チオレドキシン関連分子TMXによるレドックス制御機構の解析

新型硫氧还蛋白相关分子TMX氧化还原控制机制分析

• 批准号: 02J20128
• 负责人: 松尾 禎之
• 金额: $ 2.11万
• 依托单位: Kyoto University (2004-2005)National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (2003)
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2002
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2002 至 2005
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-02J20128/
• 关键词: チオレドキシン; 酸化還元; レドックス; ジスルフィド; 小胞体

・TMXと相互作用する分子の同定:tag配列を付加したTMXの発現ベクターを作製し、細胞への導入および薬剤による選択後、TMXを安定に発現する細胞株を樹立した。同時にインサートをもたないコントロールベクターを導入した細胞株も作製した。こうして得られた細胞から細胞抽出液を調製し、tagに対する抗体を用いて免疫沈降を行った。回収された免疫沈降物について、ウエスタンブロッティングおよびプロテーオーム解析により、構成成分の同定を行ったところ、小胞体の分子シャペロンとTMXの相互作用を示唆するデータを得た。・TMXノックアウトマウスの作製:遺伝子ターゲティングベクターをES細胞に導入し、相同組換えの起こったES細胞クローンのスクリーニングを行った。PCRにより同定されたESクローンについて、サザンブロットハイブリダイゼーションによる確認を行い、最終的に組換え体を単離した。得られた組換え体をマウス胚にインジェクションし、キメラマウスを作製した。・RNAiによるTMX遺伝子ノックダウン:ヒト培養細胞における遺伝子発現抑制を目的として、TMXのsiRNA発現ベクターを作製した。RNAiベクターを細胞に導入し、薬剤による選択後、耐性クローンを単離した。ウエスタンブロッティングにより、TMXの発現抑制効果の確認を行い、複数のTMXの遺伝子ノックダウン細胞を取得した。

Interaction, TMX と す の る molecules might be: the tag with column を plus し た TMX の 発 now ベ ク タ ー を cropping し, cell へ の import お よ び 薬 tonic に よ る sentaku, TMX を settle に 発 now す る cell lines を set し た. At the same time に イ ン サ ー ト を も た な い コ ン ト ロ ー ル ベ ク タ ー を import し た cell lines も cropping し た. こ う し て have ら れ た cells か ら cell extract を し modulation, the tag に す seaborne を る antibody with い て immune sink を line っ た. Back 収 さ れ た immune sink content に つ い て, ウ エ ス タ ン ブ ロ ッ テ ィ ン グ お よ び プ ロ テ ー オ ー ム parsing に よ り, composition の with fixed line を っ た と こ ろ, small cell body の molecular シ ャ ペ ロ ン と TMX の を interaction in stopping す る デ ー タ を た. , TMX ノ ッ ク ア ウ ト マ ウ ス の cropping: heritage 伝 son タ ー ゲ テ ィ ン グ ベ ク タ ー を に import し ES cells, the same group in え の up こ っ た ES cells ク ロ ー ン の ス ク リ ー ニ ン グ を line っ た. PCR に よ り with fixed さ れ た ES ク ロ ー ン に つ い て, サ ザ ン ブ ロ ッ ト ハ イ ブ リ ダ イ ゼ ー シ ョ ン に よ る confirm line を い, final に group in え を 単 from し た. Have to ら れ た group in え body を マ ウ ス embryo に イ ン ジ ェ ク シ ョ ン し, キ メ ラ マ ウ ス を cropping し た. Son, RNAi に よ る TMX heritage 伝 ノ ッ ク ダ ウ ン : ヒ ト culture cell に お け る heritage 伝 son 発 now inhibit を purpose と し て, TMX の siRNA 発 now ベ ク タ ー を cropping し た. RNAi ベ ク タ ー を cells に import し, 薬 tonic に よ る sentaku, patience after ク ロ ー ン を 単 from し た. ウ エ ス タ ン ブ ロ ッ テ ィ ン グ に よ り, TMX の 発 now inhibit unseen fruit line の confirm を い, plural の TMX の posthumous son 伝 ノ ッ ク ダ ウ を ン cells obtained し た.

项目成果

Yoshiyuki Matsuo: "TMX, a human transmembrance oxidoreductase of the thioredoxin family : the possible role in disulfide-linked protein folding in the endoplasmic reticulum"Archives of Biochemistry and Biophysics. 423. 81-87 (2004)

Yoshiyuki Matsuo：“TMX，硫氧还蛋白家族的人类跨膜氧化还原酶：在内质网中二硫键连接的蛋白质折叠中的可能作用”生物化学和生物物理学档案。