バキュロウイルス発現蛋白のELISA法を用いた抗デスモコリン自己抗体の研究

杆状病毒表达蛋白ELISA法研究抗桥粒胶蛋白自身抗体

• 批准号: 13670905
• 负责人: 駒井 礼子
• 金额: $ 1.54万
• 依托单位: Kurume University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• 财政年份: 2001
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2001 至 2002
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-13670905/
• 关键词: デスモソーム; デスモコリン; バキュロウイルス; ELISA; PCR; 天疱瘡; 自己免疫性水泡症; IgA天疱瘡

ヒトDsc1,Dsc2,Dsc3の全長cDNAをtemplateとして用いて、それぞれの蛋白の細胞外部位をコードするcDNAをPCRで単離し、昆虫細胞発現系であるバキュロウイルスのトフンスファーベクターにサブクローニングし、そのC末端にさらにE-tag、His-tagを挿入した。作製した各種のコンストラクトを直鎖状にした後、昆虫細胞であるSF9細胞にトランスフェクトし、相同組み換えにより、DscのcDNAをもったリコンビナントバキュロウイルスを作製し、さらに同様のサイクルを4ー5回繰り返してウイルスを増幅した。最終的に、High-Five細胞を用いてリコンビナントバキュロウイルス蛋白を多量に産生させた。このHis-tagに結合するTalon columnにより培養上清からリコンビナント蛋白を精製した。抗E-tag抗体を用いた免疫ブロット法でリコンビナントバキュロウイルス蛋白が正しく産生されていることを確認した。このヒトDscバキュロウイルス蛋白を用いたELISA法を開発した。すなわち、これらの精製リコンビナント蛋白をELISAプレートにコーティングし、さらに、一次抗体として希釈患者血清と反応後、二次抗体としてperoxidase標識抗ヒトIgGないしIgA抗体と反応させ、発色後、ELISA readerを用いて吸光度を測定した。ELISA法にて陽性所見が得られた血清について、IgA抗体に関しては、Dsc1-3のcDNAトランスフェクション法を用いて、その存在をさらに確認した。ELISA法にて陽性所見が得られた血清について、IgG抗体に関しては、Dsc1-3のバキュロウイルス蛋白を結合させたTalon resinを用いて、Dsc1-3に特異的なIgGをaffinity精製する。その精製IgGを蛍光抗体法で検索し、その特異的染色パターンの有無を検索した。

The full-length cDNA of Dsc1, Dsc2, and Dsc3 were template and amplified by PCR from extracellular sites of the proteins. Insect cell development systems were developed with the inclusion of E-tags and His-tags at the C-terminal. After the control of various kinds of virus, the insect cell SF9 cell vector vector Finally, High-Five cells are used to produce a large amount of protein. This His-tag binding process is called Talon column, and the culture supernatant is purified. Anti-E-tag antibodies are produced using the immune response method. The protein was detected by ELISA. ELISA reader is used to determine the absorbance of the purified IgG and IgA antibodies. ELISA positive results were found in serum, IgA antibody, Dsc1 -3 cDNA and its presence was confirmed. ELISA positive results were found in serum, IgG antibody, Dsc1 -3 protein binding, Talon resin, Dsc1 -3 specific IgG affinity purification The presence or absence of purified IgG antibodies can be detected by using specific staining methods.

项目成果

橋本 隆: "皮膚科専門医 Clinical Exercises、第一版、(宮地良樹、橋本 隆、編集)東京"医学書院. 182 (2001)

Takashi Hashimoto：“皮肤科医生临床练习，第 1 版，（Yoshiki Miyaji、Takashi Hashimoto，编辑）东京”Igaku Shoin 182 (2001)。

Komai A, Hashimoto T et al.: "The clinical transition between pemphigus foliaceus and pemphigus vulgaris correlates well with the changes in autoantibody profile assessed by an enzyme-linked immunosorbent assay"Br J Dermatol. 144. 1177-1182 (2001)

Komai A、Hashimoto T 等人：“落叶型天疱疮和寻常型天疱疮之间的临床转变与通过酶联免疫吸附测定评估的自身抗体谱的变化密切相关”Br J Dermatol。

Nagata Y, Hashimoto T et al.: "Paraneoplastic pemphigus sera react strongly with multiple epitopes on the various regions of envoplakin and periplakin, except for C-terminal homologous domain of periplakin"J Invest Dermatol. 116. 556-563 (2001)

Nagata Y、Hashimoto T 等人：“副肿瘤性天疱疮血清与 envoplakin 和 periplakin 各个区域上的多个表位发生强烈反应，除了 periplakin 的 C 端同源结构域”J Invest Dermatol。

Chan LS, Hashimoto T et al.: "Mucous membrane pemphigoid ; Definition, diagnostic criteria, pathogenic factors, medical treatment and prognositic factors"Arch Dermatol. (in press).

Chan LS、Hashimoto T 等：“粘膜类天疱疮；定义、诊断标准、致病因素、治疗和预后因素”Arch Dermatol。

Hamada T, HashimotoT et al.: "Bullous pemphigoid sera react specifically With various domains of BP230, most frequently with C-terminal domain, by immunoblot analyses using bacterial recombinant proteins covering the entire molecule"Exp Dermatol. 10. 256-

Hamada T、HashimotoT 等人：“通过使用覆盖整个分子的细菌重组蛋白进行免疫印迹分析，大疱性类天疱疮血清与 BP230 的各个结构域（最常见的是 C 末端结构域）发生特异性反应”Exp Dermatol。