蛍光グルコースを用いる1分間マイクロバイオアッセイ法の開発

开发使用荧光葡萄糖的 1 分钟微生物测定方法

• 批准号: 13760234
• 负责人: 斉藤 美佳子
• 金额: $ 1.6万
• 依托单位: Tokyo University of Agriculture and Technology
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
• 财政年份: 2001
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2001 至 2002
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-13760234/
• 关键词: 蛍光グルコース; マイクロバイオアッセイ

我々は、食中毒予防等の食品衛生管理の重要性から、生きた微生物の検出について、検出原理・装置の開発研究を行ってきた。その中で検出対象が「生きた状態」であることからその栄養代謝経路に注目をし、もっとも一般的な栄養源であるグルコースを基質として蛍光剤2-[N-(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)amino]-2-deoxy-D-glucose (2NBDG)を開発した。本研究では、生きた細胞を1分間という迅速に、かつ1個体の細胞を検出出来る手法の開発を目指している。(1)各種微生物への2NBDG法の応用これまで主に試験菌としていた大腸菌に加え、実際に食品から単離された大腸菌群や食中毒菌(Salmonella enteritidis、Salmonella typhimurium, Vibrio mimicus、Listeria monocytogenes、Staphylicoccus aureus, Yersinia enterocolitica, Bacillus cereus)への2NBDG取り込みを調べた。その結果、試験菌41種類のうち35種類の菌で取り込みが見られ、1分間という短い取り込み時間で蛍光顕微鏡観察に十分な蛍光強度を示した。以上の結果は、2NBDG法の食品衛生面での有用性を示すものと期待される。(2)試料調整、捕捉法の改良サンプル吸引アダプタの開発と、オートステージ移動プログラムを作成した。顕微鏡視野内に収まる径を複数作成した本アダプタを用いることで、全サンプルの確実なフィルター捕捉を可能にした。また、オートステージプログラム使用により観察の自動化が進み、観察時間が短縮された。(3)飲料水試料中の生菌の1分間アッセイ飲料水(ウーロン茶、アセロラドリンク)に大腸菌を添加し、2NBDG法による検出を行った。その結果、ウーロン茶での試験では、3〜5個以内の細胞でも検出することが可能であり、従来法であるコロニーカウント法との高い相関性を得ることが出来た。(4)標準プロトコールの完成昨年度作成したドラフトを基に、上記の結果を加えたプロトコールを作成した。

I 々 は, such as food poisoning to prevent の importance of food hygiene management の か ら, raw き た microbial の 検 out に つ い て principle, device and 検 の open 発 を line っ て き た. In そ の で 検 like が seaborne "raw き た status" で あ る こ と か ら そ の tech students.their ownship raise metabolic 経 road に attention を し, も っ と も general な tech students.their ownship keep source で あ る グ ル コ ー ス を matrix と し て 蛍 light tonic 2 - [N - (7 - nitrobenz - 2 - oxa - 1, 3 - diazol - 4 - yl) amino] - 2 - deoxy - D-glucose (2NBDG)を develops た. This study で は, raw き た cells を 1 minute between と い う に, quickly か つ 1 individual の cells を 検 out out る gimmick の open 発 を refers し て い る. 2 (1) microorganisms へ の NBDG method の 応 with こ れ ま で main に test bacteria と し て い た coliform に え, be interstate に food か ら 単 from さ れ た coliforms や food pathogens (Salmonella enteritidis and Salmonella typhimurium, Vibrio mimicus, Listeria monocytogenes, Staphylicoccus aureus, Yersinia enterocolitica, Bacillus cereus)へ <s:1> 2NBDG take the key of 込みを 込みを べた. そ の results, test bacteria 41 species の う ち 35 kinds で の bacteria take り 込 み が see ら れ, 1 minute between と い う short い take り 込 み time で 蛍 light 顕 micromirror 観 examine に very な 蛍 light intensity を shown し た. The above <s:1> results <e:1>, the <s:1> food hygiene aspect of the 2NBDG method で <s:1> usefulness を shows す <s:1> と と expectations される. (2) Sample adjustment, improvement of the capture method <s:1>, サ プ プ, アダプタ attraction, アダプタ development と, and ジ movement プログラムを to make た た. 顕 micromirror horizon に 収 ま る diameter を plural made し た this ア ダ プ タ を with い る こ と で, whole サ ン プ ル の indeed be な フ ィ ル タ ー capture を may に し た. ま た, オ ー ト ス テ ー ジ プ ロ グ ラ ム use に よ り 観 examine の が into み automation and examines 観 shortening time が さ れ た. (3) drinking water sample の in bacteria の 1 minute between ア ッ セ イ potable water (ウ ー ロ ン tea, ア セ ロ ラ ド リ ン ク) に coliform を add し, 2 NBDG に よ る 検 を row っ た. そ の results, ウ ー ロ ン tea で の test で は, の within 3 ~ 5 cells で も 検 out す る こ と が may で あ り, 従 to で あ る コ ロ ニ ー カ ウ ン ト method と の high い phase masato sex を る こ と が た. (4) the standard プ ロ ト コ ー ル の completed last year made し た ド ラ フ ト を に, written の result を え た プ ロ ト コ ー ル を made し た.

项目成果

松岡英明, 斉藤美佳子: "平成14年度マイクロバイオリアクターシステムの構築に関する基礎調査委託事業報告書"(社)農林水産技術情報協会(印刷中). (2003)

松冈英明、斋藤美佳子：《2002年度微型生物反应器系统建设基础研究委托项目报告》农林水产技术信息协会（2003年出版）。

斉藤美佳子, 松岡英明: "キャピラリーカーボンマイクロ電極"マテリアルインテグレーション. 15(2). 45-49 (2002)

Mikako Saito、Hideaki Matsuoka：“毛细管碳微电极”材料集成 15(2) (2002)。

Ki-Bong Oh, Yasuo Tajima, Mikako Saito, Il-Moo Chang, Hideaki Matsuoka: "Cytotoxicity of Extracts from Alternaria alternata against Cultured Tobacco BY-2 Cells"Biocontrol Sci. 7(2). 127-130 (2002)

Ki-Bong Oh、Yasuo Tajima、Mikako Saito、Il-Moo Chang、Hideaki Matsuoka：“链格孢提取物对培养的烟草 BY-2 细胞的细胞毒性”生物防治科学。

H.Matsuoka: "Simultaneous imaging of multiple fluorescent probes in bio-cells"Proceeding of Joint Symposium on Bio-Sensing and Bio-Imaging. (in press).

H.Matsuoka：“生物细胞中多种荧光探针的同时成像”生物传感和生物成像联合研讨会论文集。

H.Matsuoka: "Single-cell viability assessment with a novel spectro-imaging"J.Biotechnol. 94(3). 299-308 (2002)

H.Matsuoka：“利用新型光谱成像进行单细胞活力评估”J.Biotechnol。