単一グルタミン酸受容体チャネルにおけるカルシウムイオン流入過程の画像化

对单个谷氨酸受体通道中的钙离子流入过程进行成像

• 批准号: 13780633
• 负责人: 櫻井 孝司
• 金额: $ 1.54万
• 依托单位: Hamamatsu University School of Medicine
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
• 财政年份: 2002
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2002 至 2003
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-13780633/
• 关键词: グルタミン酸; カルシウム; イオンチャネル; エバネッセンス顕微鏡; 正倒両立顕微鏡; 海馬; レーザー光分解; 全反射照明; マイクロフォトリシス; 正倒両立式顕微鏡; レーザー顕微鏡

平成14年度は局所レーザー光分解(FLIP)と全反射照明(TIRF)法の二目的を両立した正倒両立式蛍光顕微鏡法を用いて、1)神経細胞の細胞膜領域に限局したカルシウム応答をの検出、2)単一グルタミン酸イオンチャネルにおけるカルシウムイオン流入の同定を行なった。海馬神経細胞におけるグルタミン酸依存性Ca応答の領域を限局させるために、負荷するCa蛍光プローブの用量を低下させ、阻害剤を用いて他の(二次的な)Ca信号をできるだけ抑制することを試みた。3種の阻害剤、すなわちNMDA型受容体阻害剤であるMK-801(10μM)、膜電位依存性Caチャネル阻害剤であるニフェジピン(10μM)そして細胞膜透過型のCaキレート剤であるBAPTA-AM(20μM)を処置するとケージドグルタミン酸(1mM)のFLIPにより誘導されるCa依存性Rhod2蛍光は著しく阻害された。TIRF法で蛍光検出を細胞膜領域に限定するとグルタミン酸刺激直後において、グルタミン酸の投与領域(直径約3ミクロンの範囲)周辺に集中した蛍光強度の増大が検出された。蛍光強度はグルタミン酸投与後12msでピークに達し、この時平均直径約0.5ミクロンのスポットとして観察された。スポットは一度のグルタミン酸刺激で、9μm平方あたり平均で3〜10個ほど出現し、出現から20ms後にはほとんどが消滅した。スポットの直径は消失まで大きく変化しなかった。グルタミン酸刺激依存性で出現するCa依存性Rhod2スポットの数は、グルタミン酸の投与範囲や投与用量に依存して変化した。以上の結果から、グルタミン酸刺激依存性で出現したスポットはCaイオンの結合により活性化した単一のRhod2蛍光分子であると結論された。スポットはTIRF法でのみ観察されたことから、Rhod2蛍光分子がガラス面(細胞接着面)に近づいたときに検出されたと考えられ、カルシウムチャネルが開いてカルシウムイオンが細胞内に入ってRhod2と結合した瞬間をとらえた可能性が高い。

In 2014, the two purposes of FLIP and TIRF methods were established and the inverted vertical microscopy method was used. 1) Detection of local fluorescence in the cell membrane domain of nerve cells. 2) Simultaneous determination of the inflow of single acid. Hippocampus neurons contain acid dependent Ca ~(2 +) signaling domain, which is limited by the amount of Ca ~(2 +) light and inhibited by the use of inhibitors. Three kinds of inhibitors: MK-801(10μM), membrane potential-dependent Ca inhibitor (10 μ M), cell membrane-permeable Ca inhibitor (BAPTA-AM(20μM)), FLIP (1mM), Ca-dependent Rhod2 inhibitor. TIRF method can detect the concentration of light intensity in the cell membrane area, and the concentration of light intensity in the cell membrane area after acid stimulation. The light intensity is about 12ms after the acid is injected, and the average diameter of the light is about 0.5 ms On average, 3 ~ 10 times of acid stimulation occur, 20ms after occurrence, and then disappear. The diameter of the needle disappears. The acid stimulus dependence appears to be Ca dependent. The number of Rhod2 species depends on the amount of acid administered. The above results show that the acid-dependent properties of Rhod2 molecules appear to be activated by Ca 2 +. The probability of Rhod2 binding to the cell surface is high, and the probability of Rhod2 binding to the cell surface is high.