ヘパラン硫酸6スルホトランスフェラーゼの基質認識機構の解明

ヘパラン硫酸6スルホトランスフェラーゼは、ヘパラン硫酸鎖の生合成過程において、6位の水酸基に特異的に硫酸基を転移する反応を触媒する酵素である。本酵素は、ゴルジ体内に局在しており、ヘパラン硫酸鎖生合成過程における最終段階の修飾を行っていると考えられている。6位の硫酸基が、ヘパラン硫酸鎖の様々な生理活性に必須であることがわかっており、この修飾反応のメカニズムを詳細に解明することは、糖鎖生物学的にも重要であると考えられる。本実験は、ヘパラン硫酸6スルホトランスフェラーゼについてX線結晶構造解析を行うことで、その立体構造を明らかにして、基質特異性と反応メカニズムの両方について、その立体構造基盤を明らかにすることを目指した。本研究期間において、ヒト由来HS6STの大腸菌での大量発現系を作成した。4種類に発現ベクターを用いて、発現系を構築し、それらの培養条件について検討した。又、精製法についても、それぞれ最適化を行った。精製法には、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィーを用いた。その結果、最高で1L培養あたり1mg程度の精製タンパク質を得ることに成功した。本精製サンプルは酵素活性を示したことから、結晶化用サンプルとして用いることができた。結晶化のスクリーニングは、ハンギングドロップ蒸気拡散法およびシッティングドロップ蒸気拡散法を併用した。2000条件以上の結晶化条件の検索を行ったが、X線回折実験に使用できる結晶を作成するには至らなかった。

ヘパラン硫酸6スルホトランスフェラーゼは、ヘパラン硫酸鎖の生合成過程において、6位の水酸基に特異的に硫酸基を転移する反応を触媒する酵素である。本酵素は、ゴルジ体内に局在しており、ヘパラン硫酸鎖生合成過程における最終段階の修飾を行っていると考えられている。6位の硫酸基が、ヘパラン硫酸鎖の様々な生理活性に必須であることがわかっており、この修飾反応のメカニズムを詳細に解明することは、糖鎖生物学的にも重要であると考えられる。本実験は、ヘパラン硫酸6スルホトランスフェラーゼについてX線結晶構造解析を行うことで、その立体構造を明らかにして、基質特異性と反応メカニズムの両方について、その立体構造基盤を明らかにすることを目指した。本研究期間において、ヒト由来HS6STの大腸菌での大量発現系を作成した。4種類に発現ベクターを用いて、発現系を構築し、それらの培養条件について検討した。又、精製法についても、それぞれ最適化を行った。精製法には、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィーを用いた。その結果、最高で1L培養あたり1mg程度の精製タンパク質を得ることに成功した。本精製サンプルは酵素活性を示したことから、結晶化用サンプルとして用いることができた。結晶化のスクリーニングは、ハンギングドロップ蒸気拡散法およびシッティングドロップ蒸気拡散法を併用した。2000条件以上の結晶化条件の検索を行ったが、X線回折実験に使用できる結晶を作成するには至らなかった。