ヘパラン硫酸6スルホトランスフェラーゼの基質認識機構の解明
硫酸乙酰肝素6磺基转移酶底物识别机制的阐明
基本信息
- 批准号:14780476
- 负责人:
- 金额:$ 2.5万
- 依托单位:
- 依托单位国家:日本
- 项目类别:Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
- 财政年份:2002
- 资助国家:日本
- 起止时间:2002 至 2003
- 项目状态:已结题
- 来源:
- 关键词:
项目摘要
ヘパラン硫酸6スルホトランスフェラーゼは、ヘパラン硫酸鎖の生合成過程において、6位の水酸基に特異的に硫酸基を転移する反応を触媒する酵素である。本酵素は、ゴルジ体内に局在しており、ヘパラン硫酸鎖生合成過程における最終段階の修飾を行っていると考えられている。6位の硫酸基が、ヘパラン硫酸鎖の様々な生理活性に必須であることがわかっており、この修飾反応のメカニズムを詳細に解明することは、糖鎖生物学的にも重要であると考えられる。本実験は、ヘパラン硫酸6スルホトランスフェラーゼについてX線結晶構造解析を行うことで、その立体構造を明らかにして、基質特異性と反応メカニズムの両方について、その立体構造基盤を明らかにすることを目指した。本研究期間において、ヒト由来HS6STの大腸菌での大量発現系を作成した。4種類に発現ベクターを用いて、発現系を構築し、それらの培養条件について検討した。又、精製法についても、それぞれ最適化を行った。精製法には、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィーを用いた。その結果、最高で1L培養あたり1mg程度の精製タンパク質を得ることに成功した。本精製サンプルは酵素活性を示したことから、結晶化用サンプルとして用いることができた。結晶化のスクリーニングは、ハンギングドロップ蒸気拡散法およびシッティングドロップ蒸気拡散法を併用した。2000条件以上の結晶化条件の検索を行ったが、X線回折実験に使用できる結晶を作成するには至らなかった。
The 6-position sulfuric acid group is a catalyst for the synthesis of sulfuric acid. This enzyme is responsible for the final stage of the synthesis of sulfuric acid in vivo. The 6-position sulfate group is essential for physiological activity, and the modification of the sulfate group is important for biological analysis. This article is aimed at analyzing the X-ray crystal structure, understanding the three-dimensional structure, understanding the matrix specificity, understanding the three-dimensional structure, and understanding the three-dimensional structure matrix. During the study period, a large number of E. coli strains derived from HS6ST were produced. 4. The development process, the development system and the culture conditions are discussed. In addition, the refinement method is optimized. Fine processing method, such as: The highest result is 1L culture. The highest quality is 1mg. The highest quality is 1 mg culture. The enzyme activity of the purified product is shown in the table below. Crystallization is a combination of crystallization and evaporation. 2000 or more crystallization conditions, X-ray reflection, use, crystallization, preparation, etc.
项目成果
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专著数量(0)
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专利数量(0)
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