ナノ分子集合組織を利用した非水系膜型バイオリアクターの開発

ナノ分子集合組織である逆ミセル溶液を限外濾過することによって、高効率な蛋白質リフォールディングが可能なことをこれまでに示してきたが、本年度は膜型反応器という特性を活かして、連続的なリフォールディング操作を行うことのできる蛋白質リフォールディングリアクターの開発について得た成果を以下に述べる。限外濾過膜を介して、分画分子量以下の低分子化合物である変性剤(本研究では尿素)や酸化還元試薬(本研究では酸化型/還元型グルタチオンあるいはシスチン/システイン)が膜内外の逆ミセル溶液間で物質移動を起こす。このときの変性剤濃度の減少速度が蛋白質のリフォールディング速度にも反映されるため、実際の変性剤濃度減少速度と蛋白質のリフォールディング挙動を測定して変性剤を効率よく除去可能な膜型反応器を設計した。一般的な透析装置(回分操作)、膜内外の逆ミセル溶液を循環させた閉鎖循環型装置、さらに中空糸モジュールを用いた中空糸膜型装置をそれぞれ作製し、酸化還元試薬組成がリフォールディング効率に与える影響については回分操作によって検討した。その結果、酸化剤の比率増加にともないリフォールディング効率が向上した。このように、瞬間的にリフォールディング反応が進行してしまう水溶液中と比較して反応が極めて遅いため、蛋白質の高次構造形成過程の観察に非常に有効な系であることがわかった。また、実際にリフォールディングが困難とされる蛋白質のインクルージョンボディを用いて本手法の回分装置を利用することで蛋白質のリフォールディングを試みた。水に不溶な蛋白質凝集体であったが、本手法によるリフォールディング操作により一部の蛋白質が水に可溶な状態で回収できた。しかしながら、回収率としては依然低いため、今後の実験条件の最適化が必要とされる。

ナノ分子集合組織である逆ミセル溶液を限外濾過することによって、高効率な蛋白質リフォールディングが可能なことをこれまでに示してきたが、本年度は膜型反応器という特性を活かして、連続的なリフォールディング操作を行うことのできる蛋白質リフォールディングリアクターの開発について得た成果を以下に述べる。限外濾過膜を介して、分画分子量以下の低分子化合物である変性剤(本研究では尿素)や酸化還元試薬(本研究では酸化型/還元型グルタチオンあるいはシスチン/システイン)が膜内外の逆ミセル溶液間で物質移動を起こす。このときの変性剤濃度の減少速度が蛋白質のリフォールディング速度にも反映されるため、実際の変性剤濃度減少速度と蛋白質のリフォールディング挙動を測定して変性剤を効率よく除去可能な膜型反応器を設計した。一般的な透析装置(回分操作)、膜内外の逆ミセル溶液を循環させた閉鎖循環型装置、さらに中空糸モジュールを用いた中空糸膜型装置をそれぞれ作製し、酸化還元試薬組成がリフォールディング効率に与える影響については回分操作によって検討した。その結果、酸化剤の比率増加にともないリフォールディング効率が向上した。このように、瞬間的にリフォールディング反応が進行してしまう水溶液中と比較して反応が極めて遅いため、蛋白質の高次構造形成過程の観察に非常に有効な系であることがわかった。また、実際にリフォールディングが困難とされる蛋白質のインクルージョンボディを用いて本手法の回分装置を利用することで蛋白質のリフォールディングを試みた。水に不溶な蛋白質凝集体であったが、本手法によるリフォールディング操作により一部の蛋白質が水に可溶な状態で回収できた。しかしながら、回収率としては依然低いため、今後の実験条件の最適化が必要とされる。