硝酸イオンシグナル伝達に関与する遺伝子の単離・解析

硝酸根离子信号转导相关基因的分离与分析

• 批准号: 14760038
• 负责人: 白石 斉聖
• 金额: $ 2.18万
• 依托单位: Kobe University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
• 财政年份: 2002
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2002 至 2003
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-14760038/
• 关键词: 硝酸イオン; 情報伝達; 遺伝子

I)外来DNAを導入した硝酸イオン情報伝達系破壊型変異体の作出と選抜ホウレンソウ培養細胞にパーティクルガンを用い、ハイグロマイシン耐性遺伝子を外来遺伝子として導入し遺伝子破壊型変異体を作出した。作出した変異体からハイグロマイシン及びクロレートを用いた薬剤耐性により硝酸還元酵素(NR)欠失変異体を選抜した。一次選抜において約3000個体、二次選抜で100個体を得た。これらを液体培地にて培養し、細胞増殖が確認された20個体を解析に用いた。得られた変異体のNR活性は全て野生型より低いことを確認した。次に硝酸イオンによる遺伝子誘導に関与すると考えられているcis配列(AGTCA配列)をGUSレポーター遺伝子に繋いだプラスミドを用い、GUS活性測定により硝酸イオンシグナル伝達の有無を確認した。この結果レポーター遺伝子活性の低い4個体の変異体を選抜した。これら変異体が硝酸イオントランスポーター遺伝子変異体ではないことを確認するため細胞内硝酸イオン含量を測定した。いずれの変異体も細胞内に硝酸イオンを取り込むことを確認した。またNRmRNA、NRタンパク質発現量を測定した結果、いずれの変異体も発現は確認されなかった。II)破壊された遺伝子断片の単離選抜した変異体からゲノムDNAを単離しTAIL-PCR法を用いて破壊された遺伝子断片の単離を行った。その結果約500bpと900bpのDNA断片を得た。これらの塩基配列を決定したがシロイヌナズナゲノム遺伝子データベースで相同性の高い遺伝子は見られなかった。

i）使用异物DNA和选定的菠菜培养细胞的硝酸盐信号破坏类型突变体用于引入湿霉素耐药基因作为外源基因，以创建基因 - 滴中断类型的突变体。硝酸还原酶（NR）缺失突变体是从使用湿霉素和氯酸盐耐药性产生的突变体中选择的。在第一次选择中获得了大约3,000个个体，在第二个选择中获得了100个个人。这些是在液体培养基中培养的，并且使用了20个具有确认细胞生长的个体进行分析。已经证实，所得突变体的所有NR活性都低于野生型的NR活性。接下来，使用质粒将CIS序列（AGTCA序列）联系起来，该质量被认为与GUS报告基因有关，该质子被认为与GUS报告基因有关，并且通过GUS活性测量确认了硝酸盐离子信号传导的存在或不存在。结果，选择了四个具有低报告基因活性的突变体。为了确认这些突变体不是硝酸转运蛋白基因突变体，测量了细胞内硝酸盐离子含量。已经证实，两个突变体都将硝酸盐离子掺入细胞中。此外，测量了NR mRNA和NR蛋白的表达水平，并且没有确认任何一个突变体的表达。 ii）从选定的突变体中分离出干扰的基因片段基因组DNA，并使用Tail-PCR分离了破坏的基因片段。结果，获得了约500 bp和900 bp的DNA片段。确定了这些核苷酸序列，但是在拟南芥基因组基因数据库中未发现具有高同源性的基因。