内在性膜タンパク質と脂質膜相互作用の単一分子力学

内在性膜タンパク質はタンパク質の膜貫通部分と脂質相互の疎水性相互作用により脂質2重膜に固定されている。生命活動にとって基本的であり、また今後の医薬開発の焦点となるこの相互作用を新しい方法で定量的に解析する方法として原子間力顕微鏡による力学的引き抜き実験を行った。培養繊維芽細胞を原子間力顕微鏡の試料台に置き、これに対して共有結合架橋剤を結合した原子間力顕微鏡の探針を接触させる。接触時間内に探針と細胞膜タンパク質のアミノ基の間に共有結合が生じるので、この後細胞と探針間距離を離す際に膜タンパク質の一部が原子間力顕微鏡探針に結合したまま膜から引き抜かれてくる。この引き抜きの様子は、探針の下方変位を記録したフォースカーブを解析することにより確認した。また、使用後の探針に対してタンパク質延伸実験を行うと探針上に数100ナノメートルの長さに延伸される物質が結合していた。この物質はタンパク質分解酵素により消失することから、細胞膜から引き抜かれたタンパク質であることが確認できた。フォースカーブの解析から、膜タンパク質は平均0・45ナノニュートンの力で引き抜かれてくることがわかった。さらに、引き抜かれたタンパク質の種類を蛍光抗体法で同定した。以上の結果は生細胞を試料としているので脂質と膜タンパク質の相互作用以外の相互作用も含まれているので、新たに脂質リポソームを調製してこれに典型的な膜タンパク質である赤血球グリコフォリンを埋めこむ実験を行った。まず純粋なリポソームをレシチンを材料として調製し、基板への吸着の強さとリポソーム自身の力学的性質の測定を行い膜タンパク質引き抜き実験を行う基礎を確立した。今後、グリコフォリンを埋め込んだリポソームを試料として脂質膜からのグリコフォリン引き抜き実験を行う。

内在性膜タンパク質はタンパク質の膜貫通部分と脂質相互の疎水性相互作用により脂質2重膜に固定されている。生命活動にとって基本的であり、また今後の医薬開発の焦点となるこの相互作用を新しい方法で定量的に解析する方法として原子間力顕微鏡による力学的引き抜き実験を行った。培養繊維芽細胞を原子間力顕微鏡の試料台に置き、これに対して共有結合架橋剤を結合した原子間力顕微鏡の探針を接触させる。接触時間内に探針と細胞膜タンパク質のアミノ基の間に共有結合が生じるので、この後細胞と探針間距離を離す際に膜タンパク質の一部が原子間力顕微鏡探針に結合したまま膜から引き抜かれてくる。この引き抜きの様子は、探針の下方変位を記録したフォースカーブを解析することにより確認した。また、使用後の探針に対してタンパク質延伸実験を行うと探針上に数100ナノメートルの長さに延伸される物質が結合していた。この物質はタンパク質分解酵素により消失することから、細胞膜から引き抜かれたタンパク質であることが確認できた。フォースカーブの解析から、膜タンパク質は平均0・45ナノニュートンの力で引き抜かれてくることがわかった。さらに、引き抜かれたタンパク質の種類を蛍光抗体法で同定した。以上の結果は生細胞を試料としているので脂質と膜タンパク質の相互作用以外の相互作用も含まれているので、新たに脂質リポソームを調製してこれに典型的な膜タンパク質である赤血球グリコフォリンを埋めこむ実験を行った。まず純粋なリポソームをレシチンを材料として調製し、基板への吸着の強さとリポソーム自身の力学的性質の測定を行い膜タンパク質引き抜き実験を行う基礎を確立した。今後、グリコフォリンを埋め込んだリポソームを試料として脂質膜からのグリコフォリン引き抜き実験を行う。