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ダイオキシン代謝酵素の創製と環境浄化への応用

二恶英代谢酶的研制及其在环境净化中的应用

基本信息

批准号：
03J05602
负责人：
新京楽
金额：
$ 1.73万
依托单位：
Kyoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2003
资助国家：
日本
起止时间：
2003 至 2005
项目状态：
已结题

项目摘要

これまでに、申請者はラットシトクロムP4501A1(CYP1A1)に対して部位特異的変異導入を行い2,3,7,8-テトラクロロジベンゾパラダイオキシン(TCDD)に対して水酸化活性を示す変異体、F240Aの作製に成功した。さらに、このTCDD代謝酵素を真核生物である酵母や原核生物である大腸菌において、シトクロムP450還元酵素(CPR)と共発現させ、その発現微生物を用いてダイオキシン類の代謝に成功した。そこで、次に土壌などでの生育に優れ、より環境浄化への応用が期待できる、放線菌においてこれらのP450の発現を試みた。宿主としては、ホストベクター系が確立しているStreptomyces lividans TK24株を用い、ラットCYP1A1およびF240Aの発現を試みた。しかし、SDS-PAGEおよびウエスタンブロッティングにおいてもP450の発現を確認することはできなかった。一方、真核生物である担子菌の中には、ダイオキシン類に対して代謝活性を示すものが存在することが知られている。この担子菌は、土壌中に菌糸を伸ばしながら成長していくため、放線菌と同様にダイオキシン汚染土壌での生育も可能であり、環境浄化への応用に適していると考えられる。そこで、まず、担子菌の1種であるwhite-rot basidiomycete Coriolus hirsutusにおいてラットCYP1A1を発現させることを試みた。この担子菌はもともとダイオキシンの1種である2,7-ジクロロジベンゾパラダイオキシン(2,7-DCDD)を代謝しうる微生物であるが、ラットCYP1A1を発現させると、その組み換え担子菌は野生型と比較して8倍以上も高い2,7-DCDD代謝活性を示すことが明らかになった。今後、TCDD代謝酵素であるF240Aの発現などを試みていく予定である。

In this regard, the applicant successfully introduced site-specific variants into P4501A1 (CYP1A1) to demonstrate the hydrolysis activity of F240A. In addition, the TCDD metabolic enzyme was successfully used in eukaryotic organisms, yeast prokaryotes, E. coli, and co-development of P450 reductase (CPR). In addition, the development of P450 in the environment is expected to be improved. The host cell line was established and tested for CYP1A1 and F240A. SDS-PAGE was used to confirm the occurrence of P450. The presence of a protein in a cell of Basidiomycetes and its metabolic activity is known. The Basidiomycetes grow and grow in the soil, and the bacteria grow and grow in the soil. The bacteria grow and grow in the soil. The bacteria grow and grow in the soil. One species of white-rot basidiomycete Coriolus hirsutus was discovered. The activity of CYP1A1 was 8 times higher than that of wild type basidiomycetes. The activity of CYP1A1 was 8 times higher than that of wild type basidiomycetes. In the future, TCDD metabolic enzymes will be developed in A predetermined manner.