エンドフィリン複合体のクラスリンを介するエンドサイトーシスにおける機能の解析

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1.エンドフィリン複合体の免疫組織化学的・生化学的的解析先にエンドフィリン複合体の因子として単離したCAM GAPI cDNAによる推定アミノ酸配列に基づいて大腸菌融合タンパク質および合成ペプチドを作製して、これを抗原としてウサギに免疫して特異的抗体の産生を行なった。採取したウサギ血清をアフィニテイー精製して、組織のウェスタンブロッテイング、免疫化学染色などによりスクリーニングしたが、内在性のCAM GAP1タンパク質を認識すると思われる特異的抗体は得られなかった。エンドフィリン複合体の解析のため、エンドフィリンおよびCAM GAP1に結合するCIN85/EBP1をテトラサイクリン誘導性に発現するChinese hamster ovary細胞を作成した。この細胞でCIN85/EBP1の過剰発現によって細胞内に形成される小胞様構造体を、抗体を用いたアフィニテイー精製によって単離した。エンドフィリン、CAM GAP1、CIN85/EBP1と共に、この構造体を形成するタンパク質因子のMALDI解析による構造決定を行なった。2.エンドフィリン遺伝子欠損マウスの作製マウスゲノムDNAライブラリーをスクリーニングして、エンドフィリン1および2遺伝子の翻訳開始コドン部分を持つ第1エキソンを含むマウスゲノムDNAフラグメントを単離した。これをもとにして、マウスES細胞で相同的組み換えにより、エンドフィリン遺伝子の第1エキソンをネオマイシン耐性遺伝子で置換するためのターゲッテイングベクターを作製した。エンドフィリン1、2遺伝子欠損マウスを作製するため、このターゲッテイングベクターをマウスES細胞に導入し、組み換え細胞のネオマイシン耐性コロニーの選別およびコロニーから単離したゲノムDNAのサザン解析によるスクリーニングを行なった。