エンドフィリン複合体のクラスリンを介するエンドサイトーシスにおける機能の解析

网格蛋白介导的内吞作用中内亲蛋白复合物的功能分析

• 批准号: 15370048
• 负责人: 根本 康夫
• 金额: $ 7.3万
• 依托单位: Tohoku University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
• 财政年份: 2003
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2003 至 2004
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-15370048/
• 关键词: クラスリン; エンドサイトーシス; リン脂質; rho GTPase; GAP; トランスフェリン受容体

1.エンドフィリン複合体の免疫組織化学的・生化学的的解析先にエンドフィリン複合体の因子として単離したCAM GAPI cDNAによる推定アミノ酸配列に基づいて大腸菌融合タンパク質および合成ペプチドを作製して、これを抗原としてウサギに免疫して特異的抗体の産生を行なった。採取したウサギ血清をアフィニテイー精製して、組織のウェスタンブロッテイング、免疫化学染色などによりスクリーニングしたが、内在性のCAM GAP1タンパク質を認識すると思われる特異的抗体は得られなかった。エンドフィリン複合体の解析のため、エンドフィリンおよびCAM GAP1に結合するCIN85/EBP1をテトラサイクリン誘導性に発現するChinese hamster ovary細胞を作成した。この細胞でCIN85/EBP1の過剰発現によって細胞内に形成される小胞様構造体を、抗体を用いたアフィニテイー精製によって単離した。エンドフィリン、CAM GAP1、CIN85/EBP1と共に、この構造体を形成するタンパク質因子のMALDI解析による構造決定を行なった。2.エンドフィリン遺伝子欠損マウスの作製マウスゲノムDNAライブラリーをスクリーニングして、エンドフィリン1および2遺伝子の翻訳開始コドン部分を持つ第1エキソンを含むマウスゲノムDNAフラグメントを単離した。これをもとにして、マウスES細胞で相同的組み換えにより、エンドフィリン遺伝子の第1エキソンをネオマイシン耐性遺伝子で置換するためのターゲッテイングベクターを作製した。エンドフィリン1、2遺伝子欠損マウスを作製するため、このターゲッテイングベクターをマウスES細胞に導入し、組み換え細胞のネオマイシン耐性コロニーの選別およびコロニーから単離したゲノムDNAのサザン解析によるスクリーニングを行なった。

1. Immunohistochemistry and biochemical analysis of エンドフィリン complex にエンドフィリン complex の factor として単利したCAM GAPI cDNA による presumed アミノ acid ligand に base づいて coliform fusion タンパク性および synthesized ペプThe production of チドをして, これをantigen としてウサギにimmune してspecific antibody production を行なった. Take したウサギ serum をアフィニテイーrefined して, tissue のウェスタンブロッテイング, immunochemical staining などによりスクリーニングしたが, intrinsic CAM GAP1 タンパク性を知すると思われる-specific antibody は得られなかった.エンドフィリンplex analysisのため, エンドフィリンおよびCAM GAP1 binds to CIN85/EBP1 and creates inducible cells in Chinese hamster ovary cells. The detection of CIN85/EBP1 in cells is the result of intracellular formation of CIN85/EBP1. The small cell structure and antibody were purified from the Biotech Biotechnology Co., Ltd.エンドフィリン、CAM GAP1、CIN85/EBP1と公に、このstructureをformationするタンパクMat factorのMALDI analysisによるStructural decisionを行なった. 2.エンドフィリン弝子无码マウスのマウスゲノムDNAライブラリーをスクリーニングして、エンドフィリン1および2缝子の译訳StartコドンPartをholdつ二期1エキソンを有むマウスゲノムDNAフラグメントを単里した.これをもとにして、マウスES cellsでThe same groupみchangeえにより、エンドフィリン伝子の 1stエキソンをネオマイシンresistant 伝子で substitution するためのターゲッテイングベクターを making した.エンドフィリン 1, 2 するため、このタ produced by マウスをーゲッテイングベクターをマウスES cells are introduced and the cells are exchanged Cellular Resistance Resistance Separation SeparationたゲノムDNAのサザンANALYSISによるスクリーニングを行なった.

项目成果

Sakakibara T, Nemoto Y, Nukiwa T, Takeshima H.: "Identification and characterization of a novel Rho GTPase activating protein implicated in receptor-mediated endocytosis"FEBS Letters. (In press). (2004)

Sakakibara T、Nemoto Y、Nukiwa T、Takeshima H.：“与受体介导的内吞作用有关的新型 Rho GTP 酶激活蛋白的鉴定和表征”FEBS Letters。