神経伝達物質に応答して蛍光を発する新規細胞型センサー

一种新型细胞型传感器，可响应神经递质发出荧光

• 批准号: 15750072
• 负责人: 中西 淳
• 金额: $ 2.3万
• 依托单位: The Institute of Physical and Chemical Research
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
• 财政年份: 2003
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2003 至 2004
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-15750072/
• 关键词: イメージング; 蛍光; 構造変化; 受容体; 神経伝達物質; センサー; ケージド化合物; 細胞接着; 光電子移動; 重ヒ素化蛍光色素

本研究では,生細胞の形質膜中に存在する受容体蛋白質を用い,同受容体の神経伝達物質の結合に伴う構造変化を検出する方法を開発すると共に,それを利用した新規細胞型センサーの開発を行った.1.受容体蛋白質として神経伝達物質のアドレナリンに対する受容体(β_2AR)を用いた.C末ループの71残基を欠損させたβ_2ARのC末端にCFP,そして第三細胞内ループ内に重ヒ素化蛍光色素FlAsHが結合するCCPGCC配列を導入した遺伝子を作成した(β_2AR229C:FP,β_2AR238CFP,β_2AR250CFP).各遺伝子をHEK293細胞に発現させた後,FlAsHで標識したところ,β_2AR250CFPにおいてCFP-FlAsH間のFRET効率が最大の値を示した.さらに,β_2AR250CFPでは,アドレナリンを添加するとFRET効率が減少し,続いて,阻害剤のICI 118,551を添加するとFRET効率の減少がおさまり,神経伝達物質に応答性を示すことが分かった.以上より,細胞型センサーの開発に成功した(投稿中).2.基板上の任意の位置に細胞を配置する技術の開発を行った.この目的のために,光分解性保護基を有する単分子膜で修飾したガラス基板を用いた.この基板に細胞接着を抑制するウシ血清アルブミンをコートした後に,光照射すると,アルブミンが表面より解離することを見出した.続いて,細胞接着を促進するフィブロネクチンを添加すると,フィブロネクチンが光照射領域に選択的に吸着し,細胞接着面が形成されること分かった.この方法を用い,一細胞を基板上の任意の位置に配置することに成功した(JACS).1,2に基づき,様々な神経伝達物質に対する細胞型センサーを集積化することで,極微少量の神経伝達物質をリアルタイムで網羅解析することが可能になると期待される.

This study aims to develop a method for the identification of receptor proteins present in the plasma membrane of living cells, and for the identification of structural changes associated with the binding of receptor proteins with receptor proteins. 1. Receptor protein and receptor protein were introduced into the receptor (β_2AR). 71 residues of the receptor protein were deleted from the C-terminal of β_2AR, and the receptor protein was introduced into the C-terminal of β_2AR.(β_2AR229C:FP,β_2AR238CFP,β_2AR250CFP). After HEK293 cells were detected,FlAsH was identified and the FRET efficiency between CFP-FlAsH and β_2AR250CFP reached the maximum value. In addition,β_2AR250CFP decreases FRET efficiency due to the addition of the inhibitor ICI 118,551. 2. Development of cell placement technology at any position on the substrate. For this purpose, the photolytic protective group is used as a molecular film to modify the substrate. The substrate is then irradiated with light, and the surface is dissociated. In addition, cell adhesion is promoted by the adsorption of selected molecules in the light irradiation field, and cell adhesion is formed. This method is used to locate any position on a cell substrate, and to collect and analyze a small amount of a cell substrate (JACS).

项目成果

先端の分析法 -理工学からナノ・バイオまで-

尖端分析方法——从科学和工程到纳米/生物——

• 发表时间: 2004
• 作者: Naoya INOUE;Toshiyuki KIMURA;Takanori NISHINO;Katsunobu ITOU;Yoshinori Okade;Yanagiya Y;前田瑞夫
• 通讯作者: 前田瑞夫

細胞を固定化した基板の作製方法およ び基板

固定化细胞的基材的制造方法及基材

• 发表时间: 2011