DNA転写反応の1分子1ステップ可視化

一个分子，一步可视化 DNA 转录反应

• 批准号: 15770103
• 负责人: 林 真人
• 金额: $ 2.05万
• 依托单位: Tokyo Metropolitan Organization for Medical Research
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
• 财政年份: 2003
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2003 至 2004
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-15770103/
• 关键词: RNAポリメラーゼ; 転写; 転写開始; DNA; 素過程; 一分子生理学; リアルタイムイメージング; ナノマシン

RNAポリメラーゼ(RNAP)はDNA鎖上の遺伝情報を写し取りRNA鎖を合成する転写反応を担っている。RNAPは、まずDNA上のプロモーター配列に結合し、転写開始点付近の二重らせんを巻き戻して塩基対を乖離させる。そして、DNA上を二重らせんに沿って移動しながら鋳型鎖と対になるヌクレオチドを次々と重合させてRNA合成を行う。本研究は、一分子のRNAPが転写を行う過程をリアルタイムで解析することを目的とした。昨年度の研究で、1本のDNAに生じるねじれ運動を光学顕微鏡下で直接観察できる実験系を開発した。具体的には、短い鋳型DNAの一端をスライドガラス表面に結合させ、他端を微小なポリスチレンビーズに結合させた。DNAのねじれ構造変化をビーズの回転運動を通して検出することができる。本年度は、まずエチジウムブロマイド(EtBr)が結合する際に起こるDNAのねじれ量変化を観察した。溶液中へのEtBrの添加、除去に伴って、ビーズが時計回り、反時計回りに回転する様子が観察された。この回転量は生化学的な方法で求められた値と良く一致した。このことから、本法によってDNAのねじれ量変化を正確に測定できることが分かった。次に、T7ファージ由来のRNAPが転写を行う際のDNAねじれ量変化の観察を行った。T7プロモーターを8個持つDNAをスライドガラスとビーズの間に張り、溶液中にT7 RNAPを加えると、ビーズが時計回りに8回転する様子が観察された。これは8個のRNAPがプロモーター付近のDNA2重らせん1回転ずつを巻き戻したことを示している。さらに、RNAPとともにNTPを加えるとビーズの回転速度が増加した。これは、転写開始および伸長時のRNAP/DNA複合体の安定性の違いを反映していると考えられる。本研究によって、転写反応の各過程におけるRNAPの活性を数分子単位で測定できるようになった。

RNA sequencing (RNAP) is a process for the synthesis of RNA sequences from DNA sequences. RNAP is a combination of DNA and DNA sequences, and a combination of DNA and DNA sequences. The DNA sequence of DNA sequences is described in detail below. This study aims to analyze the process of molecular RNAP writing. In the past year's research, the DNA of the first generation was directly observed under optical microscopy. Specifically, one end of the short and medium-sized DNA is bound to the surface, and the other end is bound to the surface. The structure of DNA is changed and the movement is changed. During the year, the number of DNA fragments was detected when they were combined with each other. EtBr is added to the solution, removed from the solution, and the time is counted. The value of this recovery is consistent with the value of biochemical methods. This method can be used to determine the DNA content. The origin of the RNAP was detected by DNA sequencing. T7 RNAP is added to the solution, and the 8-cycle DNA sequence is detected. The 8 RNAP genes are closely related to DNA 2 and 1. In addition, RNAP and NTP are increased, and the playback speed of applications increases. The stability of RNAP/DNA complex is reflected in the beginning and elongation of DNA. In this study, RNAP activity was measured at the molecular level in each process of reaction.