低分子量分子シャペロンと相互作用する蛋白質の解析

昨年度は、低分子量分子シャペロンであるαBクリスタリンと相互作用する分子をtwo-hybrid法により検索し、いくつかの陽性クローンが得られた。今年度は、その中でも、SKAP55Rという分子について解析を進めた。この分子は、SrcファミリーチロシンキナーゼであるFynと結合するFYBという蛋白質と結合する蛋白質として同定されており、その分子構造内に、PHドメインとSH3ドメインを持ち、情報伝達系のアダプター分子としての役割が予想されている。SKAP55RとαBクリスタリンを、哺乳動物細胞内に過剰発現させ、細胞内局在を蛍光抗体法で調べたところ、両者とも、細胞質での染色が顕著であった。また、免疫沈降法により、両者の結合を生化学的に調べたところ、共沈してくることがわかり、哺乳動物細胞内でも、複合体を形成していると考えられた。Two-hybridスクリーニングでbaitとして用いたαBクリスタリンは、その分子内の3カ所のリン酸化部位をアスパラギン酸に置換したリン酸化疑似変異体であったが、免疫沈降実験では、野生型、リン酸化部位をグリシンに置換した変異体ともSKAP55Rは共沈し、αBクリスタリンのリン酸化は、SKAP55Rとの複合体形成に必須ではないと考えられた。一方、SKAP55Rの哺乳動物細胞での過剰発現実験では、発現系ベクターを数種類作成したが、多くのものが低レベルの発現しか示さなかった。そこで、細胞内蛋白質分解系との関わりを調べるため、遺伝子導入後に、細胞をプロテアソーム阻害剤で処理したところ、SKAP55Rの発現レベルの高進が見られた。このことから、細胞内でのSKAP55Rの発現は、少なくとも部分的には、プロテアソーム系によって制御されていると考えられた。今後、SKAP55RとαBクリスタリンの複合体形成の細胞内情報伝達系における意義について解析を進める予定である。

昨年度は、低分子量分子シャペロンであるαBクリスタリンと相互作用する分子をtwo-hybrid法により検索し、いくつかの陽性クローンが得られた。今年度は、その中でも、SKAP55Rという分子について解析を進めた。この分子は、SrcファミリーチロシンキナーゼであるFynと結合するFYBという蛋白質と結合する蛋白質として同定されており、その分子構造内に、PHドメインとSH3ドメインを持ち、情報伝達系のアダプター分子としての役割が予想されている。SKAP55RとαBクリスタリンを、哺乳動物細胞内に過剰発現させ、細胞内局在を蛍光抗体法で調べたところ、両者とも、細胞質での染色が顕著であった。また、免疫沈降法により、両者の結合を生化学的に調べたところ、共沈してくることがわかり、哺乳動物細胞内でも、複合体を形成していると考えられた。Two-hybridスクリーニングでbaitとして用いたαBクリスタリンは、その分子内の3カ所のリン酸化部位をアスパラギン酸に置換したリン酸化疑似変異体であったが、免疫沈降実験では、野生型、リン酸化部位をグリシンに置換した変異体ともSKAP55Rは共沈し、αBクリスタリンのリン酸化は、SKAP55Rとの複合体形成に必須ではないと考えられた。一方、SKAP55Rの哺乳動物細胞での過剰発現実験では、発現系ベクターを数種類作成したが、多くのものが低レベルの発現しか示さなかった。そこで、細胞内蛋白質分解系との関わりを調べるため、遺伝子導入後に、細胞をプロテアソーム阻害剤で処理したところ、SKAP55Rの発現レベルの高進が見られた。このことから、細胞内でのSKAP55Rの発現は、少なくとも部分的には、プロテアソーム系によって制御されていると考えられた。今後、SKAP55RとαBクリスタリンの複合体形成の細胞内情報伝達系における意義について解析を進める予定である。